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(無題) 削除/引用 No.2333-15 - 2008/11/18 (火) 17:54:44 - No.5 ＞みなさん 解決しました。 どうも親切にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2333-14 - 2008/11/18 (火) 17:51:13 - Pumpkin No.5様 >primaryの脾臓細胞はRNA含量が少ないのではないか やられた実験から推測されるように、そうなのでしょう。似たような知見もあるということですし。 >細胞数に合わせるのではなくRNA含量に合わせて細胞をプットすれば良いのでしょうか？ >”ごみ”の量が多くなりますので、私なら処理する細胞数を増やしません。 私も~様と同様で初発のcell数（組織重でも）を増やしません。少し数を増やせば達成できるのであれば、4カラム分ほどの溶出RNAを合わせてEtOH沈澱で回収します。例えば3ug/カラムであれば、4本やれば12ugはとれるわけです。私は30ugほどほしいけど、10ug/カラムしかとれないサンプルの時にこのようにやっていました。

(無題) 削除/引用 No.2333-13 - 2008/11/18 (火) 17:37:51 - ~ >細胞数に合わせるのではなくRNA含量に合わせて細胞をプットすれば良いのでしょうか？ ”ごみ”の量が多くなりますので、私なら処理する細胞数を増やしません。 どうしても大量のRNAをカラムできれいにしたい時は、 一度AGPC法でRNAを抽出してから、カラムにかけるなどの対応策をとると思います。 （RNAは扱いが面倒なので、カラムの本数を増やすことを先に検討するかもしれません）

(無題) 削除/引用 No.2333-12 - 2008/11/18 (火) 17:22:45 - No.5 細胞数をきっちり測定し、細胞数を振って（10^6、3*10^6、8*10^6)行ったところ、細胞数と比例してRNAが抽出されました。それでも8*でさえtotalで3μｇ程度でした。実験自体はこのまま進めましたが、やはり収量が気になったのでいろいろ調べたところ、GE社のキット（DNaseつき）RNAspinを使用したお客様の感想がありました。この方は、私と同じprimaryの脾臓細胞を使用し細胞数が10^7で収量が1〜5μg程度とのことでした。 当然、異なるキットですので比較するには無理が有るかもしれないのですが同じ原理のキットですし、その他の細胞からは同程度のRNAが抽出できています。キャパも100μｇですし。以上のことからprimaryの脾臓細胞はRNA含量が少ないのではないかと思うのです。 こうした場合に仮にキットを使用するのであれば、細胞数に合わせるのではなくRNA含量に合わせて細胞をプットすれば良いのでしょうか？ どなたか経験が有るかたがいらっしゃいましたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2333-11 - 2008/11/16 (日) 18:08:59 - Pumpkin 確かにキャパは100ugだったとおもいますが、グアニジン濃度がメンブレンへの吸着に必要であったと思います。

(無題) 削除/引用 No.2333-10 - 2008/11/16 (日) 12:03:38 - genji Pumpkinさま ＞多い細胞数に対してｸﾞｱﾆｼﾞﾝ溶液の量が規定量ではメンブレンに対して吸着が効率的に行えない 了解しました。 プロトコル上では確かにそうですが、そうであるとしても私の経験的にはなんら問題ないという感じです。 細胞をRLTによく溶解させるためにしつこくbortexすれば十分な量のtotal RNAがとれるはずです。 メンブレンは最大100ugのtotal RNAを吸着できるのですから、グアニジン溶液の量はこのケースでは問題にならないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2333-9 - 2008/11/16 (日) 08:56:22 - Pumpkin >細胞数が問題になっているという方向性 genji様がおっしゃる通り、細胞数に応じた量のｸﾞｱﾆｼﾞﾝ溶液を入れていればよいのですが、多い細胞数に対してｸﾞｱﾆｼﾞﾝ溶液の量が規定量ではメンブレンに対して吸着が効率的に行えない(希釈されて）、という流れです。

(無題) 削除/引用 No.2333-8 - 2008/11/15 (土) 23:24:13 - genji 細胞数が問題になっているという方向性に話が流れていますが、多ければそれにこしたことはありません。 RLTを過剰に加えてよくbortexすることが重要です（1min以上）。 この後にQIAshredderで2min遠心すればいいと思います。 ペッスルでホモジェナイズする必要はないと思います。 確認ですが、1x10^7cellsまいて、300uLの上清を回収しているとのことですが、その細胞数が3x10^6cellsというわけにはいかないでしょう。 cludeなsplenocyteをまいてるのですよね？ cludeなsplenocyteの中にはmonocyte等も含まれているので、wellの底にこれらが接着するので浮遊系の細胞は3x10^6よりもっと少ないはずです。 細胞数に問題を感じるのであれば、皆様がおっしゃっているように遠心前の細胞数をきちんと測定してみるべきです。 total RNA量が1.5ugしかとれなくてもcDNAにしてRT-PCR等も十分できるし、遺伝子のクローニングもできるはずです。 ここで実験を止めているより先のステップに進んでみては？

(無題) 削除/引用 No.2333-7 - 2008/11/15 (土) 22:56:12 - No.5 ＞みなさま ご指摘ありがとうございます。 基本に立ち返ってもう一度、実験してみます。 また、うまくいかなかったらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2333-6 - 2008/11/15 (土) 21:48:54 - Pumpkin 浮遊だからとか接着だからというのは関係ないように思えます。遠心して集めた細胞ペレットにグアニジン溶液を加えて、ボルテックスすればよいと思います。プロトコル準拠していれば問題なく、ペッスルであっても問題ないように思えます。QIAshledderを用いればよいでしょう。それよりも、遠心で培地はしっかりと除けていますか？ RNA含有量の少ないNIH/3T3細胞1X10^6個で10ugのRNAが調製できるとのことですので、No.5さんは1.5ugしかとれていないことになるので少ないですね。やはり細胞数が多すぎて効率が悪いか、りょうさんの指摘の細胞が死んでいて実は細胞がないということはありませんか？このようにRNAが取れないときは、しっかりと細胞数をカウントしたほうが、他の要因だったときの解決の一助になります(プロトコルにも注意深く計測するように促してあります）。

(無題) 削除/引用 No.2333-5 - 2008/11/15 (土) 19:53:12 - りょう １ｘ10^7cells/mlって濃すぎませんか？ cytokine-ELISA用ではそのくらいで撒かれるのは知っていますが。 あと、「脾臓から細胞分離して」と記載されていますが、細胞種は何でしょうか？T細胞は維持しやすいですが、B細胞は死にやすいと思いいます。 まともにやれば、RNA取りなら1-3x10^6でもマイクログラムオーダーで回収できると思います。

(無題) 削除/引用 No.2333-4 - 2008/11/15 (土) 18:00:03 - No.5 >pumpkin様 早速の返信ありがとうございます。 ひとまずcellの量は減らしてみます。 他に思い当たることとしてホモジェナイズがあります。 現在、組織のときと同じように１．５ｍｌチューブにフィットするポリプロピレン製のホモジェナイザー（ペレットペッスル）でホモジェナイズしています。 どなたか、浮遊細胞を用いるときにホモジェナイザーが問題になったような方はいますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2333-3 - 2008/11/15 (土) 16:43:13 - Pumpkin 失礼しました、遠心法では1×10^7個以上使用しないということでした。 ですので、1カラムあたりの細胞数を減らしてみるといいと思います。その他には、培養液はしっかりと除去してありますか？グアニジン溶液が希釈されてしまうと、メンブレンに吸着できません。 とりあえず、マニュアルにあるQ&Aにある「収量が低い」の項を改善されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2333-2 - 2008/11/15 (土) 16:34:24 - Pumpkin しっかりとマニュアルを熟読してからプロトコールを起こしていますか？ 1×10^6個以上の細胞からスタートしないと記載があります。

細胞からのＲＮＡ抽出 削除/引用 No.2333-1 - 2008/11/15 (土) 16:18:48 - No.5 脾臓を細胞分離して、24ウェルのプレートに撒いてからＲＮＡ抽出をしております。キットは以前に組織をやっていたながれでRNeasy mini kitを使用しております。 24ウェルプレートに10^7個/mlにして1mlを撒いてから24時間後に300μLを遠心 で回収（つまり3*10^6個の細胞を処理）してあとはキット通りに操作しています。しかし、最後の量を30μＬにしても50ng/μＬ程度しかＲＮＡが回収できません。細胞の量が問題になっているような気がしています。もう少し量を減らして試した方がよいのか、それともプレートに撒く細胞が多すぎるのか、、、。プレートに撒く細胞量は論文等で上清を回収してサイトカインを測定するような実験を参考にしたので10^7/mLですがＲＮＡ抽出にもっていくには不向きなのでしょうか？ これまでに細胞からのＲＮＡ抽出を行っておりアドバイスがいただけるようなかたがいらっしゃたらお願いします。 これまで細胞を扱った経験がないこともあり基礎的な質問になってしまいますがよろしくお願いします。

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