全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2326-10 - 2008/11/16 (日) 14:41:53 - in situ APさま わざわざ補足ありがとうございます。 invitrogenのホームページでなぜか、特異性がThermoScript＜SuperScript�Vになっており気にかかるところです。。 原理的には反応温度が高いThermoScriptの方が特異性が高いはずなのですが、由来の酵素の特性も絡んでるのでしょうか。 それともただの販売戦略でしょうか。 おおさま 遅れましたが、プライマーの濃度の件、ご指摘ありがとうございました。 確かに、今まで、プライマーを20ul反応系で20pmol加えていたのですが（SuperScript�Vのマニュアルには20ul反応系で10〜20pmolと記載されています）、10pmolに変更してみます。

(無題) 削除/引用 No.2326-9 - 2008/11/15 (土) 14:06:33 - AP どうでもいいことかもしれませんが、訂正します。 >SuperScriptシリーズの改良バージョンだと思います。 SuperScriptはMMLV(マウスの腫瘍ウイルス）由来のRTaseをベースに耐熱性を高めるように改良したもので、ThermoScriptはAMV（トリの腫瘍ウイルス）由来でした。体温の高いトリを宿主とするAMV RTaseは至適温度が高め（42℃）ですが、さらに耐熱性を高め、もともと有している高いRNase H活性を欠除させたもののようです。

(無題) 削除/引用 No.2326-8 - 2008/11/15 (土) 12:52:08 - in situ おおさま、APさま さらにコメントありがとうございます。 APさま 酵素の由来については考えたことがなかったため、非常に勉強になりました。 ThermoScriptを第一候補で考えてみたいと思います。 おおさま RNase Protection Assayは今同時並行して進めています。 ただ、しっかり定量するとなると、毎回スタンダードとして5レーン程度は消費してしまうことなどから考えて、サンプルが恐らく最終的に300〜400程度になる今回の実験においては、できればrealtime PCRでの定量の系を確立したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2326-7 - 2008/11/15 (土) 09:49:26 - おお あ、いっその事、RTPCRをあきらめて、RNAプロテクションアッセイにすればいいかも。 センスとアンチセンスは区別して検出できますし、定量性にも優れてます(フィルムで 焼かなければ特に) ピアスからノンRIのキットが出てたと思うのですが、、、、、 それか、ノーザンかな。

(無題) 削除/引用 No.2326-6 - 2008/11/15 (土) 01:24:48 - AP お節介ですが追加情報 Thermscriptは反応温度70℃ですね。 http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/11146001.shtml トピ主さんが候補に考えていらっしゃるのはどちらもTth系の耐熱性のDNApolでRT活性をもつ酵素を使っているようです。ThermoScriptはRTaseプロパーで、SuperScriptシリーズの改良バージョンだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2326-5 - 2008/11/15 (土) 00:49:41 - おお 何か理由があってそこまでこだわってるのかなという ところが引っかかってましたが、そういうことだったんですね。 あとは試行錯誤していくしかないかなぁという気がします。 特異性でもうひとつ気がついたのですが、プライマーの量が 過剰すぎるのもよくないという気がします。 実験の性質上一定量とか、総RNA量に対して一定の割合を加え る事になるかと思えますので、過剰量は加えると思いますが、 過剰すぎることによる弊害は出るかもしれないということです。

(無題) 削除/引用 No.2326-4 - 2008/11/14 (金) 23:41:25 - in situ おおさま、APさま コメントありがとうございます。 primerに関しては、最初10mer程度でやっていたのですが、特異性が低いため、現在30mer前後のprimerを用いて検討中です。 具体的な実験内容はあまり書けない状況なのですが、PCRの段階では区別できない二つのRNA（A、B）を定量しようとしています。 これらは、量としてはA＞＞Bですので、Bに対するprimerでAも増えてしまうと、Bの変化が見えなくなります。 したがって、現在の目標としてはin vitro transcriptionしたA,Bのスタンダードに対して（他の変化に影響を与えない程度に）特異的にRTをかけることです。 酵素はSuperScript�Vを用いて、55℃でRTしていますが、よりよい酵素があれば、と探しています。 C.therm.ポリメラーゼワンステップRT-PCRシステム http://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php?product=3.6.17.2.8.1&category=32984 なんかが、良さそうなのですが、なぜかone stepしかありません… MasterAmp™ Real-Time RT-PCR System http://arb-ls.com/products/masteramp_real_time_rt_pcr_system/ も、RTの温度が70℃なのですが、メーカーが聞いたことないところで不安です。 おおさまとAPさまのアドバイスを参考にして、条件検討を続けたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2326-3 - 2008/11/14 (金) 23:06:05 - おお >[Re:1] in situさんは書きました : > 具体的には > > １．primerはどのくらいの長さだったら特異的になりうるのか PCRのプライマー程度の長さがあれば十分かと思っています。 ただし、PCRと同様にどういうわけかうまくかからないという場合もありますので、複数の設計をするか、かからない時は下手に条件ばっかりいじるより、 プライマーを変える方がいい場合が多いと思います。 > ２．primerの特異性を増すための工夫はあるのか 特に絶対的なものはないと思いますが、 塩基の種類が偏り過ぎていたり、ターゲットないのリピートの配列や、 或いはAluのような、ゲノムに頻繁に出てくるような配列は避けたいですね。 > ３．市販のRT酵素で特に特異性が高いものはあるのか 酵素の特異性というより、プライミングで決まると思います。 (PCRの特異性が酵素でなくてプライマーで決まるのと同様に) もちろんAPさんが仰っているように、高温で反応できる方が 有利です。 > ちなみに、１．に関しては現在自分で条件検討中ですが、何か情報お持ちの方がいらっしゃれば教えてくだされば幸いです。 スペシフィックな伸長反応を見るには、RTでできたcDNAを片っ端から シーケンスしたりしないと見れないと思いますが、そんなことをやって いるわけではないですよね、、、、、 おそらく、PCRがかかるかどうかとか見ているのだと思いますが、 それは特異性を見ているわけでは、、、、ま、どうでも良いですね。 もし、特異性という意味で検討する余地があるとしたら、 RNAとプライマーのミックスを熱変性するステップが ありますが、変性後の温度を変えて検討する所ぐらいでしょうか。 変性、急冷、そのあとプライミングのために55度 (とかプライマーに合わせた温度)でしばらく インキュベーション、酵素の添加といった具合でしょうか、、 でもそこまで手の込んだことはしなくても、PCRのレベルで うまくかかることが多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2326-2 - 2008/11/14 (金) 19:21:15 - AP RTの段階で特性を出す（非特異的primingを排除する）という発想はありませんでした。多少、非特異的な逆転写が起こっても、PCRで特異性を担保することで十分な実験が普通ですので。 基本的には特異性は酵素の性質に負うのではなく、primerによりますよね。 やっぱり長いプライマーほど特異性が高いでしょう。ゲノムなどから特異的なPCRかけるときと同じくらいと考えればいいのではないでしょうか。25〜30ntくらいでしょうか。それだけではなく、温度が低いとミスマッチアニーリングが起こって非特異的なprimingが起こってしまいますから、反応温度を高くする必要があると思います。なので、 >市販のRT酵素で特に特異性が高いものはあるのか というより、耐熱性で至適温度が高いものを選んだらいいのではないでしょうか。TthのようなRT活性を併せ持つ耐熱性DNA polとか、SperScriptIIIとかThermoScript（いま、何度まで温度を上がられるのでしたっけ？）などはどうですか。

Reverse Transcriptionの特異性に関して 削除/引用 No.2326-1 - 2008/11/14 (金) 15:29:14 - in situ 最近realtime PCRやRT関連のスレがいくつか立っているようなので、便乗させて質問させていただきます。 realtime PCR前のReverse Transcriptionに使用するプライマーに関してです。 通常、このプライマーに関してはrandom hexamerかOligo dT、もしくはそのmixtureを使うと思います。 最近のRTのキットなどは、バッファー中にすでにこれらのプライマーが入っているものもあります。 通常のrealtime PCRはmRNAを定量するものですし、antisenseのRNAの存在を考えることはあまりないと思うのでこれで問題ないと思います。 しかし、RNA virusなどの場合positive strand, negative strand両方のRNAを細胞内で合成する場合もあり、上記のような方法だと、これらが区別できないことがあります。 positive, strandとnegative strandを区別するにはgene specific primerを用いるしかなくなります。 しかし、最近RTの反応がどれだけ特異性が高いものなのか気にかかっています。 具体的には １．primerはどのくらいの長さだったら特異的になりうるのか ２．primerの特異性を増すための工夫はあるのか ３．市販のRT酵素で特に特異性が高いものはあるのか ちなみに、１．に関しては現在自分で条件検討中ですが、何か情報お持ちの方がいらっしゃれば教えてくだされば幸いです。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---