全24件 ( 21 〜 24 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2325-4 - 2008/11/14 (金) 15:39:59 - uPS すいません、yamutyaさんのキャリアを勿論知らないので、かなり失礼な部分もあるかと思いますが、御容赦下さい。 blockingに関してはEcoRIさんが仰るよう通りだと思います。ただ抗体によってはblocking無しでもいけたりはしますが、一般的には皆さんblockingしてると思います。 ”ある時にはあり、ある時には消えていていたり、ある時は全体的に薄かったりと再現性が無い” と書いてありますが、バックグラウンドは如何でしょうか？blockingが不十分でバックグラウンドが高くなってしまいバンドが見えないという事ではないのですか？ ”全く同じサンプルを”と書いていますが、その後に”５サンプルだったり１０サンプルだったり”とも書いてあります。この”同じ”とはどういう定義でしょう？ 例えば、先週ある細胞にある刺激を掛け回収してサンプル化したものと、今週同じある細胞にある刺激を掛け回収してサンプル化したもの、を”同じ”としてしまうと、両者に差が出てきてしまうでしょう（かつタンパク量を定量していなければ差は更に広がるでしょう）。 抗体は随時新しいものを使ってますか？それとも繰り返し？ 私は何度も繰り返して使う派ですが、何十回も使ってると流石にシグナルは減衰していきます。 また最後のカセットうんぬんのくだりが理解出来ないのですが、私が使用しているカセットは、蓋を開けて、ハイブリバックやサランラップに包んだメンブレンを置き、その上にフィルムをセットし、蓋を閉めてロックするってものです。yamutyaさんは直接フィルムの上から自分の手で押してるのですか？それだとかなりムラが出そうですけど、、そうじゃなくてロックしたものを更に押してるって事？これもあんまり良く無い気が、、だってメンブレン全体に常に同じ圧を掛けるのって難しいですよね。

(無題) 削除/引用 No.2325-3 - 2008/11/14 (金) 14:44:30 - EcoRI Tween-TBSでブロッキングですか… ブロッキングの効果が心配です skim milk, BSA, ゼラチン, PVPなどを試してください。

(無題) 削除/引用 No.2325-2 - 2008/11/14 (金) 14:35:23 - yamutya プロトコールが一部間違っていたので訂正します メンブレンに転写→５分×４回D・Wで洗浄→ポンソ染色→D・Wで洗浄→TBS-Tweenで６０分ブロッキング→一次抗体反応overnight→TBS-Tweenで５分×３回洗浄→二次抗体反応６０分→TBS-Tweenで５分×３回洗浄→TBSで５分×３回洗浄→現像 抗体濃度は色々試した結果一次抗体、二次抗体（５０００．１００００）で行っています。

ウエスタンブロットの結果に再現性がない 削除/引用 No.2325-1 - 2008/11/14 (金) 14:27:38 - yamutya 　初めて質問させていただきます。よろしくお願いします。 　今ウエスタンブロットを行っているのですがうまく行かず困っています。 　それは全く同じサンプルを用いて同じプロトコール、同じ試薬、同じ抗体濃度で実験を行っているのにも関わらず結果のバンドが、ある時にはあり、ある時には消えていていたり、ある時は全体的に薄かったりと再現性が無いことです。そのため結果に信頼性がなく、又まだ出ていないバンドもあるのでは？と考えしまい前に進めません。 プロトコールは以下のようになります 　メンブレンに転写→５分×４回→ポンソ染色→TBS-Tweenで６０分ブロッキング→一次抗体反応overnight→TBS-Tweenで５分×３回洗浄→二次抗体反応６０分→-Tweenで５分×３回洗浄→TBSで５分×３回洗浄→現像 　単純に腕の問題では？と考えたのですがポンソ染色の結果では差異が見られませんですし、その後の１、２次抗体反応では差がでるとは考えづらいです。 　日によってPAGEで流すサンプルの量（５サンプルだったり１０サンプルだったり）と違うのでその差で抗体反応時例え同じ濃度だとしてもメンブレンに転写しているタンパクの量が違うわけですから、それで抗体が不足したり過剰だったりしてそれが影響を及ぼしているのでしょうか？ 　また現像の時にフィルムカセッテにメンブレンを起きフィルムを重ね露光させるのですがその時念のため上から押さえているのですが、それが悪かったりするのでしょうか？アドバイスお願いします。

全24件 ( 21 〜 24 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---