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(無題) 削除/引用 No.2325-24 - 2008/11/17 (月) 15:12:37 - AP >[Re:19] yamutyaさんは書きました : > ４ｍｌのバッファーにある量の抗体を溶かしてその全量を抗体反応させた場合と３ｍｌのバッファーに同じ量の抗体を溶かしてその全量を使った場合抗体濃度は同じ濃度と言う事になるのでしょうか？それとも希釈しているので違うのでしょうか？私は後者だと思っています。 後者ですね。 抗原抗体反応も、化学反応の一つで、反応速度や平衡に達したときの反応産物の多さは、濃度と比例（または正の相関を）するものと理解しています。 もし、抗体の結合係数がものすごく高く、しかも抗原が抗体より過剰として、濃度に関係なく入れた抗体全部が反応しきるとしたら、希釈率が違っても抗体量が同じなら結果は同じということになるかもしれません。実際にはあり得ない話です。

(無題) 削除/引用 No.2325-23 - 2008/11/17 (月) 14:44:27 - ぱんた yamutya さん >かなり基本なことであきれられてしまうかもしれませんが、思い切って質問です。４ｍｌのバッファーにある量の抗体を溶かしてその全量を抗体反応させた場合と３ｍｌのバッファーに同じ量の抗体を溶かしてその全量を使った場合抗体濃度は同じ濃度と言う事になるのでしょうか？それとも希釈しているので違うのでしょうか？私は後者だと思っています。 濃度は当然変わりますよ。極端な話をするとわかりやすいのですが、4mLのバッファーに4uLの抗体を入れたのと、１Lのバッファーに4uLの抗体を入れたものでは、抗体濃度は同じではないですね？　これと同じです。 あと、ウエスタンの場合（特に抗体がアホだったりする場合）は、融合タンパクをポジコンとして持っておいても、悪くはないと思います。ポリクロ抗体作成時に発現させたものなどはございませんか？

(無題) 削除/引用 No.2325-22 - 2008/11/17 (月) 13:25:12 - 名無し ポンソーの染色結果が絵の具流したみたいに変なのは、ゲルと膜の密着がちゃんとできてなくて転写中に蛋白質が流れてしまっているからでしょう。そうなると、装置の状態はかなり限界にきていると思います。新規購入するならばセミドライなら炭素電極でなくて変形しにくいステンレス（みたいなやつ）の電極板を勧めます。

(無題) 削除/引用 No.2325-21 - 2008/11/17 (月) 12:35:27 - AP >してみます。二次抗体も結構高いので助かります＾ 二次抗体の使い回しは注意が必要で、特におすすめしません。 一次抗体の持ち込みがあるので、異なる一次抗体の検出には使えません。 酵素標識の場合、失活のおそれがあります。 使い回す場合、腐敗しないように防腐剤を入れておくのが望ましいですが、アジ化ナトリウムはPO標識を失活させます。 >前処理は初めて聴いた言葉なのですが（無知で申し訳ないです）どういうことなのでしょうか？ 前吸収については、過去トピにあると思いますので、探してください。 確認し忘れましたが、一次抗体なし、二次抗体のみでは非特異的バンドは全く出ませんか？　もし出るようなら、二次抗体も前吸収するといいです。

(無題) 削除/引用 No.2325-20 - 2008/11/17 (月) 12:11:56 - EcoRI >家の炭素板電極も少し形がおかしくなっており、転写の際バッファーの量が多いと、斜め下にバッファーが流れてしまい、ポンソーの結果で一部分水に絵の具を入れたときのようになってしまいます。買い替えも視野に入れて今後実験を行っていきます。 買い替えを行ってから、実験をすることを強くお薦めします。 抗体をアフィニティー精製することは可能ですか？ 自作抗体なら、抗原も調製したはずなので、可能と考えられます。 大腸菌や細胞をあたってみてください。

(無題) 削除/引用 No.2325-19 - 2008/11/17 (月) 12:07:35 - yamutya 多くのご返信に感激しております。 名無し様 家の炭素板電極も少し形がおかしくなっており、転写の際バッファーの量が多いと、斜め下にバッファーが流れてしまい、ポンソーの結果で一部分水に絵の具を入れたときのようになってしまいます。買い替えも視野に入れて今後実験を行っていきます。 uPS様 wash条件を色々変えてみて最適な条件を検討してみます。uPS様のwash条件も参考にさせて頂きます。 qq様 おっしゃるとおり抗体は研究室の昔の先輩が作成したもので血清の上清をとったポリクロ抗体です。なので交差反応は大丈夫だと思いますが純度は悪いと思います。 AP様 ＞その抗体が異種でも交差するかという点、どのくらい見込みがあるのでしょう。たとえば、その菌の酵素活性がその抗体でブロックされるとか、その酵素を欠損している系統では絶対に出ないバンドであるとか、サポートはありますか。 実際破壊株ではそのバンドは出ないと言う結果は出ています。しかし類縁菌では私が個人的に行ったタンパクのホモロジー検索で８０％、９０％（扱っている菌は２種類。しかしNBRCナンバーが違いその扱っている菌の塩基配列は分かっていないので、定かではないです；；）と分かっている程度です。 前処理は初めて聴いた言葉なのですが（無知で申し訳ないです）どういうことなのでしょうか？ネットで調べた限り余分な交差反応する抗体を除く事ができるとあるのですが・・。 ＞一回使ったら捨てているのですか。 抗体は一回つかったら捨てています。メリットが多いので次から何回か使って試してみます。二次抗体も結構高いので助かります＾＾ 　 aimar様 思い切って抗体濃度を上げて試してみようと思います。 かなり基本なことであきれられてしまうかもしれませんが、思い切って質問です。４ｍｌのバッファーにある量の抗体を溶かしてその全量を抗体反応させた場合と３ｍｌのバッファーに同じ量の抗体を溶かしてその全量を使った場合抗体濃度は同じ濃度と言う事になるのでしょうか？それとも希釈しているので違うのでしょうか？私は後者だと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2325-18 - 2008/11/15 (土) 15:54:05 - AP >>抗体は随時新しいものを使ってますか？それとも繰り返し？ >抗体は大体２回使ったらなくなるようにエッペンに分注して保存してあります。凍結融解を繰り返すのは良くないと聞いたもので これは、希釈してブロットと反応させた抗体液を回収して使い回しているかということを聞いていたのだと思います。一回使ったら捨てているのですか。 だいたい抗体希釈液は、数回は使い回せます。抗体の節約という意味ももちろんありますが、 ・使い回すうちに前吸収と同じ効果が得られる。 ・数回使うと思うと、希釈率を思い切って下げる（抗体の濃度を高くして使う）という選択もしやすい。 などの利点もあります。

(無題) 削除/引用 No.2325-17 - 2008/11/15 (土) 15:45:33 - AP >その中で自分があたりをつけている付近のバンドが出たり出なかったり、薄かったりするので困っています。 非特異的なバンドがいっぱい出ている中で、そのバンドがホンモノかどうかというのも怪しいわけですよね。目をつけているバンドも非特異的に染まっているだけかもしれないわけで。SDS-PAGEで全タンパクを染色しても、サンプルのロットや保存期間、ゲルのロットの違いかなにかで、見えたり見えなかったりするバンドはありますから。反応の弱い、非特異的反応でも、タンパク質がたくさんあるところでは染まって見えますし。 なかなか厳しい戦いを挑んでいらっしゃるように思います。 まず、その抗体が異種でも交差するかという点、どのくらい見込みがあるのでしょう。たとえば、その菌の酵素活性がその抗体でブロックされるとか、その酵素を欠損している系統では絶対に出ないバンドであるとか、サポートはありますか。 >当然違う菌なのですから非得意はいっぱいでます。 別種だということが非特異的バンドがでる理由にはならないと思います。その点ではブロッキングを工夫してみる価値はあると思います。 新しい抗体を作るとか手に入れるというのが難しくても、今ある抗体を精製すれば、進展があるかもしれません。理屈の上では、精製しなくても非特異的反応が出るだけで、特異的シグナルは見えるものだと思えますが、実際は未精製だと非特異的バンドばかりで目的の標的にはかすりもしないように見えた抗体でも、精製するとちゃんと見てくるということも経験します。問題の菌のエキスで前吸収してみるなど、試してみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2325-16 - 2008/11/15 (土) 14:16:54 - aimar 転写か一次抗体処理に問題がありそうですね。 転写はポンソーで染色できているとのことなので全く転写されていないということはないと思うのですが、転写具合に問題があるかも。 あとはqqさんがおっしゃっているように一次抗体の特異性ですね。 自分で作ったポリクロは、出来損ないの抗体だと、バンドが出たり出なかったりした経験があります。 一次抗体の希釈を減らして（1：1000とか）やると、コンスタントにバンドが出るようになりました（私が作った抗体の場合）。 ノンスペが心配なので、そのときはスキムミルクを入れた方がいいですけどね。

(無題) 削除/引用 No.2325-15 - 2008/11/15 (土) 09:29:13 - qq 1次抗体の特異性が大変重要になると思いますが、そこのところは大丈夫でしょうか？ 研究室で作ったポリクロ抗体ではないかと思うのですが、如何でしょうか？モノクロだときっと交差反応性を期待する事自体危険かもしれませんから。 そこで、抗体作成用に用いた抗原の純度は完全ではないでしょうから（失礼）、決定的なノンスペを確定、もしくは除去することも重要だと考えます。 出たり出なかったりする対象を限定できる方がこのましいです。

(無題) 削除/引用 No.2325-14 - 2008/11/15 (土) 03:56:57 - uPS あ、すいません。連投で。 可能であればloading controlになるようなblotも同時に さらに出来ればその目的の酵素のblotで使わない領域だとなおさら良いかと。

(無題) 削除/引用 No.2325-13 - 2008/11/15 (土) 03:44:26 - uPS シグナル全体ではなく、あたりをつけた幾つかのシグナルが、時に出現、時に消失ということですね。理解できました。 > 今回の実験の趣旨として、ある菌のある酵素の特異抗体を用いてその菌の類縁菌では酵素が発現しているのか？又しているならば何時発現しているのか？を調べる実験です。当然違う菌なのですから非得意はいっぱいでます。 つまりその類縁菌ではその酵素があるかどうか、また有ってもアミノ酸配列は不明と言う事ですか。菌間で抗原部位に微妙な差が有り、その結果抗体が外れやすいとか？すいません、抗原抗体反応をきちんと理解していないので、1アミノ酸変異がそのような事を引き起こすのか、それとも完全に反応しなくなるのかわかりませんが。どなたか御存知でしょうか？ ともあれ私なら同時に数枚メンブレン（もちろん同じサンプル）を用意し、ポンソーで同量のトランスファーを確認後（ただこれはタンパク質全体を把握できるだけですが）、抗体のwashの条件を幾つか検討します。一つは今まで通り、残りはより回数を増やすなりBuffer条件を厳しくするなり。因に私のメンブレンwash用のTBSTは50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.1% Tween-20で、一次抗体、二次抗体後ともに5min×8回です。他の方より、強め、長めだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2325-12 - 2008/11/15 (土) 01:01:38 - 名無し 転写に問題があるようにおもいます。ウェットタイプだとスポンジが古くなってつぶれてくると転写の具合がおかしくなってきます。密着が不均一になり転写される部分とそうでない部分が出てきてゲルや膜の億場所により再現性がなくなってきます。スポンジが新しいの古いのがいくつもあるラボだとどれを使ったかで結果が左右されたりします。セミドライでも炭素板電極だと使っているうちに変形してきますので、同様のトラブルが生じますので、ゲルを置く場所により結果が安定しなくなります。

(無題) 削除/引用 No.2325-11 - 2008/11/14 (金) 20:16:35 - AP >私は、どうせSDSで変性させてるから、今更DWで変性しようが大した影響はないだろうという感じで、DWで洗っています。 ちょっと試料を漁ってみたら、水でリンスせよ、とするプロトコールもありますね。バイオラッドとか。 >洋土社・無敵のバイオテクニカルシリーズ「タンパク質実験ノート」下 のウェスタンの項目に疎水性相互作用で吸着させるとありましたので、 そういうものと思っております。 PVDFは疎水結合のみ、NCは疎水結合力と静電気力による吸着の両方が、おもな結合力のようです。transfer bufferにSDSを加えた場合でも、疎水性のPVDFでは疎水結合力でblotができるのに対し、NCだとかなりロスしてしまうのは静電気力を中和してしまう、あるいはタンパク質にカップリングしたSDSが反発してしまうからということみたいです（Pall, BioRadなどの資料から）。

(無題) 削除/引用 No.2325-10 - 2008/11/14 (金) 19:24:49 - misawa 抗体との反応はどのように行われていますか？ パラ舟ですか？

(無題) 削除/引用 No.2325-9 - 2008/11/14 (金) 18:54:46 - yamutya EcoRI様、uPS様、AP様ご返信ありがとうございます。 今回の実験の趣旨として、ある菌のある酵素の特異抗体を用いてその菌の類縁菌では酵素が発現しているのか？又しているならば何時発現しているのか？を調べる実験です。当然違う菌なのですから非得意はいっぱいでます。その中で自分があたりをつけている付近のバンドが出たり出なかったり、薄かったりするので困っています。抗体が悪いのは十二分に承知ですが何か他に操作で悪い点があったら是非教えていただきたいです。 EcoRI様 ＞Tween-TBSでブロッキングですか… たまに０．６〜２％程度のスキムミルクも入れてますが特異抗体の阻害が心配なため入れていません。バックグラウンドが高くなるということはないです。 uPS様 ＞バックグラウンドが高くなってしまいバンドが見えないという事ではないのですか？ 説明不足で申し訳ありません。自分の文章力のなさを痛感します。 バックグランドが高くて見えないと言うことは無いです。結果で出た様々なバンドがあるのですが同様の実験をするとその中の一部のバンドだけなくなっていたり（一回目と二回目の結果を見比べる残っているバンドは似たような濃さです。）ある時は新しく出てきたり、全体的に薄くなったりしてしまいます。これが本当に不思議で「なんで他のバンドが出ているのにそこだけ消えたり。増えたりするの？」と首を傾げてしまいます・・。 ＞”全く同じサンプルを”と書いていますが、その後に”５サンプルだったり１０サンプルだったり”とも書いてあります。この”同じ”とはどういう定義でしょう？ ５サンプルの中のあるサンプルと、１０サンプルの中のあるサンプルは全く同じと言うことです。ただ違うサンプルを増やして流しただけです。 ＞抗体は随時新しいものを使ってますか？それとも繰り返し？ 抗体は大体２回使ったらなくなるようにエッペンに分注して保存してあります。凍結融解を繰り返すのは良くないと聞いたもので ＞また最後のカセットうんぬんのくだりが・・・ uPS様がおっしゃる通りロックした上から押さえています。抑えたほうが露光がしっかりとすると習ってやっていたのですが、やはりやらないほうがいいのですね。 AP様 ＞現像液の管理や交換頻度は？現像液がへたると全く像が薄くなったり出なかったりします。 私も何度か現像液が写らなくなるという経験をしてますのでおよそ一ヶ月少々で変えるようにしています。 温度に関しましては使うときはあらかじめ低温室から出し常温に戻すようにしていますが温度管理まではしておらず、少し冷たい状態でやっています・・。 膜はPVDF膜を使っています。次からはTBSで洗浄するようにします。

(無題) 削除/引用 No.2325-8 - 2008/11/14 (金) 18:12:10 - EcoRI >たんなる直感からくる懸念で、根拠はありません。タンパク質をDWにさらすというのに生理的な拒否感がありまして。 なるほど。そういう事情でしたか 私は、どうせSDSで変性させてるから、今更DWで変性しようが大した影響はないだろう という感じで、DWで洗っています。 >ニトロセルロースの場合は、はがれやすいので転写直後に洗わずに、一旦乾燥させて固着を強めさせてから先に進めるという流儀もあります。 確かに流儀ですね。 >ニトロセルロースもそうだとされているんでしょうか。 洋土社・無敵のバイオテクニカルシリーズ「タンパク質実験ノート」下 のウェスタンの項目に疎水性相互作用で吸着させるとありましたので、 そういうものと思っております。

(無題) 削除/引用 No.2325-7 - 2008/11/14 (金) 17:59:34 - AP >横レスすみません。これは初耳なのですが、本当ですか？ たんなる直感からくる懸念で、根拠はありません。タンパク質をDWにさらすというのに生理的な拒否感がありまして。 PVDFは疎水結合といわれていますが、ニトロセルロースもそうだとされているんでしょうか。こちらは単なる吸着のような気がしますが。ニトロセルロースの場合は、はがれやすいので転写直後に洗わずに、一旦乾燥させて固着を強めさせてから先に進めるという流儀もあります。

(無題) 削除/引用 No.2325-6 - 2008/11/14 (金) 17:28:54 - EcoRI >転写後のメンブレンの洗浄は蒸留水なんですか？　低イオン強度でタンパク質の変性やはがれ落ちが心配です（PVDFならはがれにくそうだけれど、ニトロセルロースだったりしますか）。PBSとかTBSではだめなんでしょうか。 横レスすみません。これは初耳なのですが、本当ですか？ PVDFやNCMとタンパク質との結合は、疎水性相互作用と聞いています。 (だからこそ、Tween-20がブロッキング剤としても働くと考えます。) この作用が、イオン強度で変わってくるのですか？

(無題) 削除/引用 No.2325-5 - 2008/11/14 (金) 17:16:41 - AP まず、現像の問題が思い浮かびました。 現像液の管理や交換頻度は？現像液がへたると全く像が薄くなったり出なかったりします。 現像温度は？　寒くなってきましたけれど、現像液が20℃以下だったか、18℃以下だったかになると全く現像が進みません。自動現像機なら温度コントロールがついているものもあると思いますが、そうでないときはちゃんと温度計を使って温度を管理していないと、現像結果が一定しません。 実験そのものだと、転写の結果が、時々によってばらつくきやすいと思います。毎回新しいバッファーを使うとそうでもないですが、SDSの濃度上昇が関係するようで、ゲルの前処理の違いや枚数などによってはSDSの持ち込みが多くなるので影響がある場合もあります。 転写後のメンブレンの洗浄は蒸留水なんですか？　低イオン強度でタンパク質の変性やはがれ落ちが心配です（PVDFならはがれにくそうだけれど、ニトロセルロースだったりしますか）。PBSとかTBSではだめなんでしょうか。 Tween-20は界面活性剤として使われる他、ブロッキング作用もあるとされていて、ブロッキング剤の選択肢の一つとして載っている実験書もあります。バックグラウンドの問題でなければ、この点は関係ないと思います。

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