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(無題) 削除/引用 No.2321-11 - 2008/11/17 (月) 14:19:34 - マッキー このキットでRNAはイソプロパノール沈澱のときに除かれるみたいです。 RNaseを処理して再度抽出を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2321-10 - 2008/11/17 (月) 13:00:05 - おお >[Re:9] ~さんは書きました : > なんとなく、その2kb以下のサイズはRNAの気がしますが。 わしもそう思う。

(無題) 削除/引用 No.2321-9 - 2008/11/17 (月) 12:51:55 - ~ なんとなく、その2kb以下のサイズはRNAの気がしますが。 少しサンプルを分注して、RNase処理±で一度泳動してみてはいかがでしょうか。 ざっとしかFlexiGene DNA AGF3000 Handbook - English (PDF)を見ても、 どこにもRNAについての記述が見当たりません。 このキットでは、RNAはどのように除かれるのでしょうか？

みなさんありがとうございます。 削除/引用 No.2321-8 - 2008/11/17 (月) 11:43:00 - マッキー サンプルについては単層培養細胞をはがして遠心分離し、上清を除いたものをサンプルとして使用しています。なのでアポトーシスが起こり始まっていたという可能性は少ないのではと自分の中では考えているのですが…。 あとアガロースで検出されるものとしては2000bpより小さいものがスメア上に検出される状態です。

(無題) 削除/引用 No.2321-7 - 2008/11/14 (金) 14:01:51 - AP このキットは知りませんでしたが、便利なものがでているのですね。one-tubeで細胞のlysis、核の沈殿、核膜のlysis・プロテアーゼ処理からDNAの沈殿までできるのですね。 途中にDNAを含む溶液のトランスファーのステップがある方法なら、先の細いピペットチップだと剪断される可能性がありますが、この場合それはないと。 5秒程度の短時間のvortexはマニュアルにそう書かれているので、限度を越えてかけるのでもない限り問題はなさそう。 ただし、最終的にDNA沈殿を溶解するときの「Low speed」のvortexという指示はひょっとすると危険かもしれません。基本的には放置して自然に溶けるにまかせ、チューブの転倒や軽いタッピングでゆるく撹拌する程度にした方が安全だと思います。 結局、マニュアルに従っている限り、そんなにひどい分解は起きなさそうです。 あとは、元の生物サンプル中ですでに分解が起こっていた可能性です。DNAが低分子量になっている場合のトラブルシューティングでマニュアル中、一つだけあげられているのがこれですね。細胞が死んで自己分解が起こっている可能性や、アポトーシスが始まってゲノムの断片化が起こっているなど。 サンプルの種類や保存方法で思い当たることはないでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2321-5 - 2008/11/14 (金) 13:49:44 - おお >[Re:4] ~さんは書きました : > 洗ったはさみで、1mL用ブルーチップの先端を切って口径を広くして使っています。 口径の広いチップも売ってますよね。

(無題) 削除/引用 No.2321-4 - 2008/11/14 (金) 12:55:26 - ~ 洗ったはさみで、1mL用ブルーチップの先端を切って口径を広くして使っています。 >せん断されてしまったDNAが多く検出される。 どのくらいのサイズに、どのくらいの量が見られるのでしょうか？ ゲノミックPCRで増やそうとしている配列はどのくらいの長さですか？ ゲノミックPCRの目的にもよりますが、増幅部分がintactなゲノムDNAが、それなりの量残っていれば、増幅はできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2321-3 - 2008/11/14 (金) 07:14:01 - おお >[Re:1] マッキーさんは書きました : > ピペッティングやボルテックスなどには注意を払っているのですが、 あ、ボルテックスはしない方がいいと思いますが、 転倒混和とか表現が難しいですね、、、 てで、自然な動作でできる程度って感じでしょうか、、 エタチンの時の遠心もDNAが切れる原因になりえますが、 50kbps以上のDNA断片(PCRには十分な長さ)をえるにはさほど 問題がないと思います。 ピペッティングは1000ul、200ulのチップはちょっと無理があるかもしれません。 濃度にもよりますし、1、2回のピペッティングですぐにダメになるようなものでは ありませんが、、、1mlのメスピペットなどをなるべく使うとか 工夫の余地はあると思います。 DNAはどれくらいの量電気えいどうに回していますか? 量がおおすぎると、どういうわけかいちぶDNAが低分子に引きずられて、 歪な感じになることがあります。

(無題) 削除/引用 No.2321-2 - 2008/11/14 (金) 07:00:03 - おお もともとのサンプルの状態は疑う余地はないですか。

ゲノムDNAの抽出について 削除/引用 No.2321-1 - 2008/11/14 (金) 01:47:54 - マッキー 最近ゲノミックPCRを行うためにゲノムDNAの抽出を試みています。 抽出はキアゲンのFlexigeneというキットを使用しているのですが、抽出がうまい具合（→具体的には抽出サンプルをアガロースで検出するとゲノムDNAも検出されるのですが、せん断されてしまったDNAが多く検出される。DNAの精製度はOD260/OD280：1.89、OD260/OD230：1.65です）にいきません。 ピペッティングやボルテックスなどには注意を払っているのですが、私自身ゲノムDNAを初めて扱うものでどこまで注意をすればよいのかちょっと困惑しています。（転倒混和もどの程度まで強く混和してよいものなのかなどもわからない感じです） また抽出の際、細胞を溶解する時もどの程度時間をかけて溶かすべきものか（各々のキットによるとは思いますが）困惑してます。 製品元のhelpに問い合わせもしているのですが…。 どなたか参考になる情報を教えていただけないでしょうか？ また、これを読んでみたらみたいな参考図書などの情報でもありがたいです。 よろしくお願いします。

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