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(無題) 削除/引用 No.232-9 - 2008/11/18 (火) 13:37:37 - なかい 「siRNAによるoff target効果の網羅的解析をarrayで行った論文」を 読んでみたいのですが、 お分かりの方、 教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。。。

(無題) 削除/引用 No.232-8 - 2007/09/25 (火) 00:44:48 - miRNA ありがとうございます。off target効果に関して日ごろ感じていた疑問が氷解しました。

(無題) 削除/引用 No.232-7 - 2007/09/24 (月) 17:56:36 - そば おっしゃるように、抑制効果はケースバイケースという認識で間違いありませんが、”RNAiによる発現抑制（完全相補による標的切断効果）”は非常に強いのでレポーターの系であれば50%以上の抑制は簡単に観察できるはずです（50〜95%抑制の間で効果が変動する、といった具合。主に内在のmiRNA量の影響によるものと考えられます）。 統計学的有意差を確認するのは大事ですが、取らずとも「あ、効いているな」と分かるくらいの差が得られるようじゃないとちょっと不安ですね（タンパク発現確認の際にウェスタンで「よし、バンド出てる」と似た感覚でしょうか）。 もちろん、データは多い方が良いので有意差は取っておく方が良いです。 他のトピックで別の方が指摘されていますが、変異を導入したとしてもon targetを肯定することにはなりますがoff targetを否定することにはなりません。基本的に”On targetである確からしさ”を上げていくしかないのが現状です。確からしさを上げる方法の１つとして、miRNAの予測標的部位に変異導入を行うことは十分意味のあることだと思います。 ちなみに、siRNAによるoff target効果の網羅的解析をarrayで行った論文がトップジャーナルに載ったことがあるくらいですから、「off target効果が無いことの証明」は現実的に不可能と思っておく方が無難です。

(無題) 削除/引用 No.232-6 - 2007/09/24 (月) 07:32:20 - miRNA そばさん。詳細なお答え本当にありがとうございます。非常によく分かりました。 ただ、Luciferaseアッセイの抑制効果の大きさはケースバイケースという理解でよろしいでしょうか？ （たとえば、Luciferase発現量の倍率変化が小さくても、replicateで統計学的有意差がでれば確認実験としてOKということでよいでしょうか？） また、off-targetをさらに否定したい場合には、レポーターに導入した3'UTR配列に変異を入れたりして確認するのでしょうか？ 追加質問で恐縮ですがお教え頂けましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.232-5 - 2007/09/23 (日) 22:30:36 - そば LuciferaseやGFPなどのレポーター遺伝子の3'UTRに、mature miRNAと完全に相補的な配列を導入したベクターを構築し、miRNAとco-transfectionした場合のレポーター遺伝子発現抑制効果（miRNAによるRNAi効果）を確認することです。 miRNAがmiRNPに取り込まれていれば、標的mRNAの切断によるレポーター遺伝子発現抑制効果が見られるはずです。少なくともこのデータがあれば、導入したmiRNAがmiRNPに取り込まれ、activeな状態にあると考えるのに十分だと思います。 ただ、内在のmiRNAの発現量が高いと、導入したmiRNAによる（追加）抑制効果が観察されにくくなるので、細胞株は研究に用いているmiRNAの発現量が低い細胞株を使えば良いです（HeLaや293などの一般的な培養細胞株で見やすいものを選んでおくのが無難でしょう。一応、細胞株間によるmiRNA/miRNA*の取り込み効率の違いは現在までに報告されていないと思いますし）

(無題) 削除/引用 No.232-4 - 2007/09/23 (日) 20:52:19 - miRNA ご回答ありがとうございます。 そばさん。”mature miRNAがmiRNPに取り込まれてactiveな状態になっている”のはどういうアッセイで確認するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.232-3 - 2007/09/23 (日) 18:39:29 - そば 特に論文に書く必要は無い（もしくはdata not shown）ですが、確認はしておくべきだと思います。 miRNAをトランスフェクションとのことなので2本鎖もしくはヘアピンをトランスフェクションしているのだと思いますが、この際に必ずしもmature miRNAがmiRNPに取り込まれているとは限りません。”mature miRNAがmiRNPに取り込まれてactiveな状態になっている”という点ははきちんと確認しておくべきです（ちなみにmiRNA発現ベクターのトランスフェクションの場合でも同じ） 「自分で構築したタンパク発現ベクターからタンパクが強制発現している事を確認すること」と同程度の基本確認事項という認識でいてくれると大変ありがたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.232-2 - 2007/09/22 (土) 15:44:04 - 通りすがり 観察している現象にmiRNAの発現が関係あるなら発現確認しといた方がいいんじゃない？

miRNAの発現確認 削除/引用 No.232-1 - 2007/09/22 (土) 09:21:01 - miRNA miRNAをtransfectionにより強制発現させる実験の際に、miRNA自体の発現を確認する必要はあるでしょうか？(論文化の際に)

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