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(無題) 削除/引用 No.2318-6 - 2008/11/14 (金) 10:54:36 - EcoRI 皆様のご指摘の通り、おそらく、DNAの切り出しの問題かと思われますが… ヒートショックなどでは、さほど問題になりませんが、 エレクトロポーレーションでは、ライゲーション溶液をそのままトランスフォーメーションにもってくることはお薦めしません。 おそらく、キュベットのなかで、火花が飛んで、菌がダメになります。 ライゲーション溶液に対して、エタ沈をして脱塩を行ってください。 もしかしたら、フェノクロもすべきかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2318-5 - 2008/11/14 (金) 10:44:55 - huri-za さまざまな意見ありがとうございます。大変参考になりました。まずはここで紹介していただいた方法で実験をやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2318-4 - 2008/11/13 (木) 22:01:57 - ~ １．切り出し時に、回収するDNAにはUVを一切当てない 　（波長が切り出し用かどうかに関わらず、一切当てない。マーカーとサンプルのウェルの端の部分だけを切りだし、そこをEtBrにつけて位置を確認する。切り出す残りのゲルはEtBrにつけない） ２．BAP処理したベクターもアガロースゲルで泳動して切り出す。 　切れ残りのベクターによってコロニーが出てくると面倒です。 ３．ライゲーション反応はうまくいった実績がありますか？ 　同じ試薬を使ってだれかうまく行った人がいるのでなければ、条件などを間違えているか分かりません。 　とりあえず、4度O/Nのサンプルも作っておく。（あまり意味は無いかも） ４．ライゲーションに回すDNA量は10ngかそれ以上くらいにしておく 　それぞれのステップのワーストケースを考えて、それでもコロニーが十分に得られる量をライゲーションする。 　1%がライゲーションされた場合、0.1ng出来ますので、10^7cfu/ug DNAのコンピでも、10個以上は取れることになります。 　BL21のコンピだと、10^6cfu/ug DNA位でしょうから、この条件だとコロニーが1個取れるかどうかになります。 ５．トランスフォーメーション時には、コントロールを置く 　コントロールは、切る前のベクターと、XhoI処理後に切り出したpET15-b 　前者が生えてこなければ、根本的にトランスフォーメーションがおかしい。 　後者がたくさん生えてくると、サンプルのコロニーから当たりを拾うのが大変になる→ベクター側を電気泳動して切り出す必要がでてくる ６．トランスフォーメーションに回すライゲーション産物の量と、ケミカルコンピの比率は1:20以下にしておく。 　ライゲーション溶液を持ち込むと、形質転換頻度が落ちます。 ７．トランスフォーメーション後にプレートに撒く際には、全量を撒く 　たまに、一部だけ撒いて、残りを捨てる人がいますが、生えてこないかもしれないので、全部撒いておく。 　プレートを2枚用意して片方は蓋を開けて30分くらいインキュベーターに入れておけば、開けてない方に100uL、開けたほうに残り（1mL位）を撒くことが出来ます。

(無題) 削除/引用 No.2318-3 - 2008/11/13 (木) 21:17:34 - おお BL21にいれないで、クローニング用のK株の大腸菌(DH5alpha、Top10、XL1Blue、 Sure、JM109、、挙げたらきりがないですが)に入れまずDNAをとってから、 発現系の大腸菌(BL21など)に入れてください。 電気えいどうで目的の位置にバンドが見えないのは、 そんなに気にしなくて良いと思います。ライゲーションさ れるパターンは無数にありますし、見えないレベルの 量でも、クローニング用の大腸菌ならカバーできる 効率のコンピテントを作ることができます。

(無題) 削除/引用 No.2318-2 - 2008/11/13 (木) 19:23:06 - A ゲルから切り出しているということはXhoIは問題なく働いていると解釈して問題ないですね。 私を含めこの掲示板でコロニーが得られないという相談があった時は大抵ゲル切り出し時のUVランプによってDNAが傷つけられそれが原因でコロニーが得られないことが多いようです。私はそれだけのことで以前3ヶ月無駄にしました。UVランプを代えただけでコロニー０だったのが数百になりましたから。 UVランプの波長を確認してください。もしはっきりしないようなら切り出すゲルに確認用１レーン（数マイクロ）、切り出し用１レーン（残り全て）をのせて電気泳動し、それらを分離して確認用のゲル上での目的バンドの位置を確認、それをリファレンスとして切り出し用のレーン上の目的バンドの位置を推定してUVランプを使わずに切り出すことができます。後はあらかじめエチブロをゲルに入れたものを使って流したDNA量が十分であれば目視で赤い目的のバンドが見えます。とにかくまずはUVランプを疑ってください。

ライゲーションについて 削除/引用 No.2318-1 - 2008/11/13 (木) 18:44:28 - huri-za 初めて質問させていただきます。今形質転換体を構築しているのですがプラスミドの構築がうまくいきません。反応は以下のとおりで行っています ・プラスミド（pET15-b）→Xho�Tで37℃、3時間処理後、BAPC75（takara）を加え、６０℃１時間反応。その後フェノクロを２回行ってエタ沈。 ・インサート→puc19からXho�Tで切り出し（37℃、2時間）アガロースゲルで電気泳動後ゲル片を切り取り、ロシュのhigh pure PCR cleanup micro kitで精製。 ライゲーション反応は ・ベクター：インサート濃度比＝1:5 ・T4 DNA ligase(wako)を使い、16℃でオーバーナイト で反応させています。反応液の半分をBamH�Tで切って電気泳動で確認しても目的の場所にバンドが見られず、残り半分を使ってコンピ（BL21）に形質転換してもコロニーがまったく出てきません。いったい原因は何でしょうか？ご教授お願いいたします。

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