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(無題) 削除/引用 No.2317-9 - 2008/11/17 (月) 17:42:01 - まる まるです。 早速のご返事ありがとうございました。 私が一度やってみたときは、ストレーナーを通した残渣は、 ほとんど白くてべったりな感じでしたが、褐色の粒が多少混じっていました。 やはりそこでロスしていそうですね。 そこを考慮して行ってみたいと思います。 himeさまが教えて下さったサイトも一読しました。 ここで言っている細胞分離器を用意できるかどうか分かりませんが、 コラゲナーゼ液と脂肪組織の重量比と、コラゲナーゼ処理後の静置時間についての考察も、 参考にさせて頂きたいと思います。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.2317-8 - 2008/11/17 (月) 14:42:19 - りょう 実験していた当時、まいた時点ではcell countしてませんので不明。 しかし、少なくとも60mm-dishくらいには撒かないと撒ききれないくらいだったと思います。 残渣の色は白いですか？褐色だったら充分バラバラになってなくて、メッシュでロスしてるのかもしれませんね。 かなり強くpipetting(先端を遠沈菅の底に押し付けてながら）しても細胞は死にませんよ。泡立てるのはNGでしょうが。 酵素処理も30minでは短かった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.2317-7 - 2008/11/17 (月) 14:14:03 - まる 投稿者のまるです。 ありがとうございます。 一匹から１０ｃｍにまけるほどとれるんですね。 ちなみに一匹からですと、最初どれくらいの細胞量がとれるものなのでしょうか？？ あと細かいことで申し訳ありませんが、 酵素処理後に溶液をセルストレーナーを通したあと、かなりのべっとりした脂肪分と細胞が ストレーナーを通らず残っているように見えるのですがこんなものなのでしょうか？ 何度もすみませんが、教えていただけると有り難いです。

(無題) 削除/引用 No.2317-6 - 2008/11/17 (月) 13:01:34 - りょう 尻尾を切っておいてgenotypeと照らし合わせて実験に使っていましたから、量的には1匹分を10cm-dish1枚にまいても良いくらい増殖しますよ。 一部は不死化すると思いますので早い段階で一部をfreeze stockしておけば毎回マウスをさばかなくて良いです。

(無題) 削除/引用 No.2317-5 - 2008/11/17 (月) 10:36:06 - まる 投稿者のまるです。 お忙しいところたくさんの方にご返事いただき、ありがとうございました。 まとめての御礼となり申し訳ありません。 教えていただいた論文などを参考に、再度チャレンジしたいと思います。 伺ったお話からは、やはり酵素処理とその後のほぐしが不十分なのかという気がしております。 starting materialの量については、匹数は１０匹程度を一度に使用しているので、 少しは回収出来ることをきたいしているのですが。。

(無題) 削除/引用 No.2317-4 - 2008/11/13 (木) 19:58:11 - hime コラゲナーゼとディスパーゼを使って分離しています。 J-tokkyoを参考にアレンジしました。 http://www.j-tokkyo.com/2007/C12N/JP2007-185157.shtml （私の方法の詳細は残念ながらコンフィデンシャルです） 私も撹拌インキュベータを使って30min〜60minほど処理していますよ。

(無題) 削除/引用 No.2317-3 - 2008/11/13 (木) 19:33:56 - fish うちでは、adultのWATからよく回収している研究員がいますが、 量がなかなか稼げないといってるのを聞いたことがあります。 一番強いコラゲナーゼでやってたとおもいます。 newbornとのことですが、starting materialの量は大丈夫でしょうか？ りょうさんのアドバイスに沿ってやるのがベストでしょうが・・ 見当違いならすいません。。

(無題) 削除/引用 No.2317-2 - 2008/11/13 (木) 18:53:18 - りょう 僕は下記論文のmethodの通りに行いました。 生後1日、3日由来の2種類とも上手く調製できました。 コラゲナーゼ処理は大腸菌を培養するような攪拌インキュベーターで150rpm/minくらいで30-40min行った記憶があります。 それでも結構細胞塊が残るので、ピペッティングを強めに行ってばらしました。血球系は浮遊状態でコンタミするので、dishにpreadipocytesを接着後、よくPBSでwashして培養しました。白色脂肪由来のものと遜色ない感じで量的に取れた記憶があります。 Klein J, Fasshauer M, Ito M, Lowell BB, Benito M, et al. (1999) β3-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. J Biol Chem 274: 34795-34802.

褐色脂肪組織からの脂肪前駆細胞のとりかた 削除/引用 No.2317-1 - 2008/11/13 (木) 17:28:49 - まる よろしくお願いします。 最近、newbornマウスの肩胛骨間から褐色脂肪組織をとり、 褐色脂肪細胞の前駆細胞をとりたいと思い試しておりますが、まったくうまくいきません。 採取した組織をミンスして、コラゲナーゼ処理（1mg/ml, 37℃、30分）後、100umのセルストレーナーに通し、遠心して回収という方法ですが、血球細胞ばかりとれ、肝心の細胞がとれません。 コラゲナーゼ処理が足らないのでしょうか・・しかし参考論文どおりにやってみているのですが。 他になにか気をつけることなど、またアドバイスなどありましたら宜しくお願いします。

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