全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2312-13 - 2008/11/14 (金) 16:12:32 - ふぁいあ みなさま、御助言ありがとうございました。 そうですね。とりあえずはデータの集積に努めることにします。 相補の実験は大変参考になります。 また、必要に応じて抗体の作製→ウエスタンも行っていこうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2312-12 - 2008/11/14 (金) 13:55:22 - おお >[Re:10] ふぁいあさんは書きました : > で、いろいろと考えてみたのですが、shRNAの安定発現株に対象遺伝子のゲノム領域をプラスミドに入れて、GFP、もしくはタグつきで発現させるというのはアリでしょうか？ 多分ややこしいだけで、あまり解決方法になっていないと思います。 ウエスタンか当面のあいだはRTPCRでやっていくか決めれば良い話です。

(無題) 削除/引用 No.2312-11 - 2008/11/14 (金) 12:49:36 - ~ >shRNAの安定発現株に対象遺伝子のゲノム領域をプラスミドに入れて、GFP、もしくはタグつきで発現させるというのはアリでしょうか？ エンドのタンパク質を検出できていないと言う点で、これだけでは足りないと思いますが。 ノックダウンした細胞では、何らかの表現型がでていて、 そのタンパク質の機能についての解析を論文にするためにノックダウンを確認しようとしているのですよね？ どうせcDNAを入れるのでしたら、 shRNA発現細胞株に、shRNAに耐性の（ホモロジーのある部分に変異を入れた）cDNAも発現させて、 表現型がリカバリーするかを示してはいかがでしょうか。 shRNAを入れたときの表現型についての解析でクレームがつくとしたら、 KDの効果と非特異KDについてでしょうから、 リカバリーすれば、最低限、目的のタンパク質による表現型であることは示せると思います。

(無題) 削除/引用 No.2312-10 - 2008/11/14 (金) 08:33:37 - ふぁいあ おおさん、ありがとうございます。 やはり最終的にはタンパクレベルのノックダウン効果を証明する必要があるということですね。自分もそう思います。 で、いろいろと考えてみたのですが、shRNAの安定発現株に対象遺伝子のゲノム領域をプラスミドに入れて、GFP、もしくはタグつきで発現させるというのはアリでしょうか？ これならばFACSやウエスタンでタンパクレベルのノックダウン効果が見られますし、スプライシングの過程も経るので、かなりエンドな環境に近似できると思うんですが… もちろんサイズ的に可能なものに限りますが。

(無題) 削除/引用 No.2312-9 - 2008/11/13 (木) 20:57:32 - おお >[Re:6] ふぁいあさんは書きました : > おおさん、ありがとうございます。 > > タンパクレベルでの確認となると、やはり抗体が必要ですかね。 > うーむ…どうしたものやら… >[Re:1] ふぁいあさんは書きました : > お世話になります。宜しくお願い致します。 > > 現在、いくつかの遺伝子に対して、shRNAによるRNAiを行っているのですが、 > ノックダウン効果がRT-PCRで見られない遺伝子があります。 > RT-PCRレベルできちんとノックダウン効果が見られる遺伝子もあるのですが、これは遺伝子の種類によるものなのでしょうか？ > ちなみに、1遺伝子あたり3つのshRNA(安定発現)を導入しているのですが、 > RT-PCRで効果が見られるものは3つ全てで効果が見られ、RT-PCRで効果が見られないものは3つとも効果が見られませんでした。 斜め読みをしてましたので読み返してみました。 エンドのRTーPCRレベルではつじつまがあうわけですね。 そういう意味では、たぶん、RT PCRの結果はノックダウンの 効果を今回の場合は反映しているという判断でいいのでは ないでしょうか。 過剰発現の系でKDできても、エンドがKDできるかは すでに複数の人からコメントがありますし、そういうこと だと思います。 ですから、今回はGFP融合タンパクの強制発現はとりあえず 無視しても良いのではないでしょうか。 ただパブリッシュする段階でウエスタンでノックダウンが うまくいっているかというデーターが要求される可能性が 大であることを頭の片隅にインプットしておくのがいいかと おもいます。 各サンプルから、タンパク用につかえるライセートを取っておいて セーブぐらいはしておいても良いかと思います。 で、効いていない遺伝子に関しては、設計のし直し も考えないといけないかもしれませんね。 3つ設計して3つともダメというのはがっくりですけど。 3つともOKのやつで運を使い果たしたのでしょうか、、、 あと細胞を変えてみる手はないですかね。

(無題) 削除/引用 No.2312-8 - 2008/11/13 (木) 13:30:18 - ふぁいあ 定量的RT-PCRもやりましたが、コピー数でコントロールと優位な差は見られませんでした。GAPDHとの比較も行いましたが同じでした。

(無題) 削除/引用 No.2312-7 - 2008/11/13 (木) 12:49:44 - - RT-PCRはReal Time PCRでしょうか？ もしそうでなかったら、定量的な判定はなかなか難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2312-6 - 2008/11/13 (木) 12:16:23 - ふぁいあ おおさん、ありがとうございます。 タンパクレベルでの確認となると、やはり抗体が必要ですかね。 うーむ…どうしたものやら…

(無題) 削除/引用 No.2312-5 - 2008/11/13 (木) 12:13:37 - ふぁいあ IRESさん、さっそくの御返信、ありがとうございます。 RT-PCRについては全てshRNAのターゲットとなる部位を挟んだプライマーを用いております。 また、過去にGFPを安定発現させた培養細胞に、GFPに対するshRNAを安定発現させたことがありますが、この時も、FACSではほぼ完全にGFPの発現が抑制されていたのに対し、RT-PCRではコントロールと同じぐらいのバンドが検出されていました。もちろん、この時使用したプライマーもshRNAの認識配列を挟んでいました。 抗体があり、ウエスタンができる場合は良いのですが、私が対象としている遺伝子はどれも抗体が市販されていないのです。自分で作製することも考えましたが、対象としている遺伝子の数を考えますとかなり難しい状況にあります。

(無題) 削除/引用 No.2312-4 - 2008/11/13 (木) 12:12:59 - おお >[Re:3] おおさんは書きました : > translationの阻害も考えられるから、WBとかでタンパク見た方が > ベターです。 > > mRNAレベルで下がっているものだけを使うというてもありますが、 > やはり、内在性の物を最終的にはWBすることになると思います。 > > 過剰発現のものが抑えられているとそのRNAiは有望ですが、 > エンドに効果があるといい切れないです。 あ、あくまでもタンパクのKDを考えている場合です。

(無題) 削除/引用 No.2312-3 - 2008/11/13 (木) 12:11:39 - おお translationの阻害も考えられるから、WBとかでタンパク見た方が ベターです。 mRNAレベルで下がっているものだけを使うというてもありますが、 やはり、内在性の物を最終的にはWBすることになると思います。 過剰発現のものが抑えられているとそのRNAiは有望ですが、 エンドに効果があるといい切れないです。

(無題) 削除/引用 No.2312-2 - 2008/11/13 (木) 12:05:41 - ＩＲＥＳ 過剰発現で効果の見られる配列が内因性のものを抑える可能性はあると思いますが直接的な証明ではないので、やはり確認は必要と思います。 RNAで難しいようでしたらWBでは出来ないでしょうか？ それからRT-PCRに用いるプライマーの増幅領域にshRNAのターゲット領域を含むようにプライマーを設計すると良いかと思います。

ノックダウン効果の検証方法 削除/引用 No.2312-1 - 2008/11/13 (木) 11:45:24 - ふぁいあ お世話になります。宜しくお願い致します。 現在、いくつかの遺伝子に対して、shRNAによるRNAiを行っているのですが、 ノックダウン効果がRT-PCRで見られない遺伝子があります。 RT-PCRレベルできちんとノックダウン効果が見られる遺伝子もあるのですが、これは遺伝子の種類によるものなのでしょうか？ ちなみに、1遺伝子あたり3つのshRNA(安定発現)を導入しているのですが、 RT-PCRで効果が見られるものは3つ全てで効果が見られ、RT-PCRで効果が見られないものは3つとも効果が見られませんでした。 そこで、GFP-目的タンパク質の融合タンパク質と、RT-PCRで効果が見られなかったshRNAを同時に導入してFACSでGFP強度を測定しました。 すると、コントロール(GL2に対するshRNA)を導入した場合と比較して90%近くもGFP強度が低下していました。 ノックダウン効果の検証方法として、RT-PCRでは効果が見られなかったけれども、この様な過剰発現系ではあるがタンパクレベルで効果が見られた場合、内在性タンパク質のノックダウンも効果的にできていると判断してよろしいものなのでしょうか？皆さんのご意見をお聞かせいただければと思います。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---