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(無題) 削除/引用 No.2308-10 - 2008/11/13 (木) 05:47:53 - おお >[Re:9] tomoさんは書きました : > すみません、微妙に誤記入がありました。3V（実測値）, 4mA（設定値）です（あまり変わりませんが）。この設定は、実際にはCCです。電圧が5V刻みでしか設定できない電源装置を使っているため、次のような手順で設定しました。 > �@CVとなるように、電圧=5V, 電流=50mA（excess）に設定して短時間通電し、電流値が8mAになることを確認。 > �ACCとなるように、電圧=5V, 電流=4mA（8mAの1/2）に再設定し、泳動開始。このときに電圧値が3Vでした。 もしかしたら、規格されたキャパより小さいためうまく電気が流れてないのかもしれませんね。電圧5V刻みなら5-10V位で流した方がいいかもしれません。 温度の方はコールドルームを使うとか、深めのトレーみたいな物に氷をいれて、 電気えいどうそうをおくとかすれば、若干高くてもいいかもしれません。 9V乾電池使えるかも(笑)。

(無題) 削除/引用 No.2308-9 - 2008/11/13 (木) 00:08:15 - tomo すみません、微妙に誤記入がありました。3V（実測値）, 4mA（設定値）です（あまり変わりませんが）。この設定は、実際にはCCです。電圧が5V刻みでしか設定できない電源装置を使っているため、次のような手順で設定しました。 �@CVとなるように、電圧=5V, 電流=50mA（excess）に設定して短時間通電し、電流値が8mAになることを確認。 �ACCとなるように、電圧=5V, 電流=4mA（8mAの1/2）に再設定し、泳動開始。このときに電圧値が3Vでした。 確かに電流値が低すぎるとは思います。バッファーなどの作り間違いを疑って、既に一度試薬類を作り直してみたのですが、同じ感じです（謎）。 私もmolecular cloning（古いver.）で確認したのですが、アルカリアガロースゲルでの電気泳動では中性の電気泳動と比較して同程度の電圧でも大きな電流が流れるため、また熱でゲルがゆるむため「0.25V/cm」とありました。ゲル長が10cmなので2.5Vに設定しようと思い、上記のような手順を踏みました。ちなみに、最初よく考えずにmupidで泳動したらヒューズが切れました。それと、BCGを入手したので、次回は加えてみるつもりです。

(無題) 削除/引用 No.2308-4 - 2008/11/12 (水) 22:15:37 - AP >実は、3時間泳動してもXCはウェルからまったく移動していませんでした。 それはおかしい。TAEなんかのときより、ずっと泳動速度ははやいくらいなんですが。謎 >泳動は4V, 3mAで行いました これはよくわからないのですが、設定を電圧と電流、両方で行っているということですか？だとしたら、どちらか低い方が上限ですね。電圧を決めればバッファーの抵抗によって電流量は決まってしまいますから、電流値の設定は意味がないですよね。アルカリバッファー、4Vで3 mAというのは低すぎないですか。それとも、3 mAは設定値ではなく実測値？ 電圧はもっと高くてしてもいいのでは。Molucular Clonignでは<〜3.5 V/cmとなっていますから、電極間距離が20 cmなら70 Vくらいまでかけられることになりますが。私は、mupidで50 V（これ以下がないやつ）でやっていました。熱でゲルがゆるむのでコールドルームにいれて、マグネチックスターラーで撹拌しながらでしたが。

XCの移動度 削除/引用 No.2308-3 - 2008/11/12 (水) 21:49:27 - tomo APさま ご回答ありがとうございました。 実は、3時間泳動してもXCはウェルからまったく移動していませんでした。電流値だけでなく、電極から気泡が出ていたことからも、電流が流れていたことは間違いありません。どう解釈すればよいのでしょう（XCはこの条件では移動しないのか or さらに長時間泳動を続ければ移動するのか）。

(無題) 削除/引用 No.2308-2 - 2008/11/12 (水) 20:49:47 - AP キシレンシアノール（XC）が見えてるなら、ゲル長の1/3から1/2くらいまで移動する程度でいいんじゃないですか。ゲノムDNAくらい大きいものなら、XCより上に見えるはずです。

DNAの質の検定のためのアルカリゲル泳動について 削除/引用 No.2308-1 - 2008/11/12 (水) 18:57:52 - tomo 抽出したゲノムDNAにニックが入っていないかどうかを確認するために、アルカリアガロースゲルによる変性条件下でのDNAの電気泳動を行っています。秀潤社「バイオ実験イラストレイテッド２」p.124のプロトコールを参考に行いました。 泳動に使っているbufferなどの組成は以下の通りです。 ・アルカリ泳動バッファー 　50mM NaOH, 1mM EDTA ・アガロース 0.8% アガロース, 50mM NaOH, 1mM EDTA ・アルカリローディングバッファー 　300mM NaOH, 6mM EDTA, 36% グリセロール (原典では18% フィコール400), 　0.25% キシレンシアノール, 　0.15% ブロモクレゾールグリーン（研究室になく今回入れませんでした) ・中和バッファー 　1M Tris-HCl (pH7.6), 1.5M NaCl サンプルをあらかじめエタノール沈殿させておきアルカリ泳動バッファー10μlに溶かし、2μlのアルカリローリングバッファーを加えて泳動しました。 泳動は4V, 3mAで行いました（原典では2.5V CVでしたが、研究室の電源装置の都合で）。また、原典では「BCGがゲルの2/3くらいに移動するまで」とあったのですが、今回は加えることができなかったので、とりあえず1時間と3時間流してみました。中和した後にエチブロで染色しUVで写真をとりましたがゲル上で全くDNAが流れてない状態でした。 この程度の泳動条件では通常どのくらいの時間泳動をするのでしょうか？　また今回入れていたキシレンシアノールは全く動いてなかったのですが、これは移動しないのが普通なのでしょうか？　それとも単に泳動時間が短かったのでしょうか？　ご経験のある方、どうぞ教えてください。

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