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(無題) 削除/引用 No.2306-9 - 2008/11/13 (木) 14:31:33 - EcoRI コンストラクトはあなたが作製したものではないのですか？ でしたら、作製手順を教えてもらい、プラスミドがどういう構造(pBS由来のプロモーターやORFの位置関係)をもっているのかを確認すべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2306-8 - 2008/11/13 (木) 14:26:57 - AP >すいません、ここの部分の意味がわかりません。 >fusionタンパクを作らないように、工夫はしました。 lacプロモータ-lacZ飜訳開始（リボゾーム結合配列、RBS: ribosome binding seqeunce/site）-lacZ構造遺伝子の途中まで-インサート という構造になると思いますが、fusionにならないようにしたというと、インサート自体が大腸菌の飜訳開始配列までと含んでいるということでしょうか。さたらにプロモータ配列まで含んでいるということはないのですよね。

(無題) 削除/引用 No.2306-7 - 2008/11/13 (木) 14:10:31 - おお >[Re:6] Kさんは書きました : > > > lacZにORFをin-frameにしてfusionにするのでしょうか。 > > すいません、ここの部分の意味がわかりません。 > fusionタンパクを作らないように、工夫はしました。 ここのストラテジーを間違えているとダメだと思いますが、、、 マルチクローニングサイトにORFをほりこむと、上流のLacZとのフュージョンになるか、LacZとフレームが合わず、違うペプチドができてしまいます。 それともマルチクローニングサイトにプロモーター、ORF、ターミネーターまでの発現ユニットを入れたということでしょうか。それだと、pBSのラクトース(IPTG)誘導プロモーターを使ってないことになります。 この辺は今使っている系がちゃんと働くにしても働かないにしても、理解して置いた方がいいと思います。F'の維持を確認しても無駄に終わる可能性がありますし、、、

(無題) 削除/引用 No.2306-6 - 2008/11/13 (木) 13:53:08 - K >[Re:5] APさんは書きました : > 誘導がかかっていない、というのはIPTGを入れても変化がない、けれど入れなくても発現しているという理解でいいですか。 その通りです。 >[Re:4] APさんは書きました : > XL1-Blueといってもバリアントがありますが、F'の乗っている系統（ただのXL-1 BlueとかXL-1 BlueMRF'）であることは確かでしょうか。また、宿主を調製するとき、あるいは形質転換体を継代するときにF'のセレクションをしていますか（XL1-BlueだとF'にテトラサイクリン耐性遺伝子が乗っているので、テトラサイクリンで選択可能）。 テトラサイクリン添加で再度トランスフォーメーションしてみます。 > pBlueScriptでタンパク質を発現させるというのは、どういうコンストラクトのデザインになっているのでしょうか。タンパク質の精製のストラテジーは？ 精製ストラテジーは過去文献に従います。 > lacZにORFをin-frameにしてfusionにするのでしょうか。 すいません、ここの部分の意味がわかりません。 fusionタンパクを作らないように、工夫はしました。 >[Re:3] EcoRIさんは書きました : > pBSってタンパク質発現用ベクターじゃないような… 調べてみたところそのようですね。 指導してくれる先生がおっしゃってたので調べませんでした･･･。 別のホストに移して誘導をかけてみます。 > それはさておき。 > うーん、培地中にラクトース-likeな物質が多量にあるってことですかね？ > IPTGを無視できるくらいの。 > > 培地はどんなものを用いているのでしょうか？ 培地はLB-Ampです。 > IPTGの用量依存的に収量があがるなんてことはありませんか？ これを期待してたのですが、ありませんでした。 >[Re:2] おおさんは書きました : > XL-1 Blue > のF'が落ちてしまっているとか > F'にlacIqがのってますから。 上記の方法で検討してみます。 皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2306-5 - 2008/11/12 (水) 19:51:47 - AP >IPTGを添加しても発現誘導はかかっていません。 >しかし、目的のタンパク質は回収されています。 誘導がかかっていない、というのはIPTGを入れても変化がない、けれど入れなくても発現しているという理解でいいですか。

(無題) 削除/引用 No.2306-4 - 2008/11/12 (水) 19:49:43 - AP おおさんの指摘のように、F'が落ちているとlacオペロンのリプレッサーlacI^qが発現しないので、IPTGなしでもconstitutiveに発現してしまいます。 XL1-Blueといってもバリアントがありますが、F'の乗っている系統（ただのXL-1 BlueとかXL-1 BlueMRF'）であることは確かでしょうか。また、宿主を調製するとき、あるいは形質転換体を継代するときにF'のセレクションをしていますか（XL1-BlueだとF'にテトラサイクリン耐性遺伝子が乗っているので、テトラサイクリンで選択可能）。 pBlueScriptでタンパク質を発現させるというのは、どういうコンストラクトのデザインになっているのでしょうか。タンパク質の精製のストラテジーは？ lacZにORFをin-frameにしてfusionにするのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2306-3 - 2008/11/12 (水) 17:49:48 - EcoRI pBSってタンパク質発現用ベクターじゃないような… それはさておき。 うーん、培地中にラクトース-likeな物質が多量にあるってことですかね？ IPTGを無視できるくらいの。 培地はどんなものを用いているのでしょうか？ IPTGの用量依存的に収量があがるなんてことはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2306-2 - 2008/11/12 (水) 17:07:47 - おお XL-1 Blue のF'が落ちてしまっているとか F'にlacIqがのってますから。

IPTG誘導がかかりません 削除/引用 No.2306-1 - 2008/11/12 (水) 16:37:43 - K ベクター　pBluescript�U 大腸菌　XL-1 Blue を使用しています。 IPTGを添加しても発現誘導はかかっていません。 しかし、目的のタンパク質は回収されています。 IPTG濃度0mMでも発現しています。 インサートがないベクターのみでは発現はありません。 目的はタンパク質の精製なので 収量はそれほど問題ではないのですが なぜ誘導がかからないのかわかりません。 この系では誘導がかからないということはないですよね？ 何かわかる方がいらっしゃいましたら、よろしくお願いします。

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