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(無題) 削除/引用 No.2302-8 - 2008/11/14 (金) 11:30:27 - mom-a >検量線の傾きはだいたい0.98前後〜ですが、（中略）効率はそれほど悪くないと思います。 重箱の隅をつつくようで申し訳ないですが、0.98前後〜というのはR2の値でしょうから、これは相関や精度の問題であって、検量線の傾き（PCR効率の指標）とは別の話になりますから、ごっちゃにならないように書かれた方が良いです。（ついでに、「E5〜E1希釈」というのも公比10で5段階希釈したのだろう、と検討はつきますがAMさんもE1の方を低濃度と思われたように、一般的な表現ではないと思います。） どうやら、低濃度側のバラツキが大きいことが検量線の傾きに影響していたようですね。 >発現量の低いDNA（Ct値が30〜32サイクルのもの）を目標としている ということだと、 >E2はUndetermined〜33サイクルぐらいまでかなりばらついていました というのは、測定条件としてはなかなか厳いかもしれませんね？低濃度側のバラツキが多い部分を除いて引いた検量線でサンプルの範囲がカバーできれば問題ないですが、サンプルのCt値が32サイクルだと、E2が33サイクルだったりundeterminedだったりというのは、このくらいの量を定量するには精度が悪いということではないでしょうか。E2はバラツクけれど、サンプルの値はばらつかないんですか？30サイクルくらいならばらつかないのかな…。 4wellにしないと精度の良い検量線が引けないのなら、低濃度のサンプルも1サンプルにつき4well以上使わないと精度が悪いのでは。 >プレート間での差の指標として、同一のcDNAを両方のプレートで用い、検討しています これは、どのように使っているのですか？値が同じになるかの確認ですか？このcDNAの値を基準にして補正に使っているのですか？

(無題) 削除/引用 No.2302-7 - 2008/11/14 (金) 11:24:54 - AM ウェル数が足らないならば、検量線を保存しておいて別ランにアプライするという方法があります。そちらでご使用のソフトにそういう機能はついていませんか。 つまり何ラン分かの検量線をみて再現性があれば、毎ランごとに検量線を加える必要は無く、ラン間補正用にプレート共通にポジコン(検量線の中の再現性の良い高コピーのもので可)を加えておくだけでよいのです。あとNTCもいります。 毎回段階希釈の手ブレが考慮されてしまう検量線を使用しないので、そのほうが特に低コピーのサンプルのブレが少なくなってきます。 私の使用している機器は32サンプルしか測れないものなので、サンプル数が多い場合は反応条件検討を兼ねて検量線のチェックを行い、検量線を保存(エクスポート)して、別ランでアプライ(インポート)しています。 実は、相対定量ならば傾きのみを使用してCt値からエクセルでも計算できるのですが(ラン間誤差の補正は別問題なので行います)、報告するときにメンドウなのでソフトの機能を利用してしまっています。 ご参考までに。 http://relative.gene-quantification.info/

参考になりました。 削除/引用 No.2302-6 - 2008/11/14 (金) 02:24:58 - リアルタイム野郎 AMさんありがとうございます。検量線の傾きはだいたい0.98前後〜ですが、まれに0.8台の時もありましたが、これについては、手技上のミスだと考えており、効率はそれほど悪くないと思います。おっしゃられた通り、低濃度を省いていくつかひきなおしてみたところ、-3.3に近づき、R^2値も1に近づきます。私は発現量の低いDNA（Ct値が30〜32サイクルのもの）を目標としているのですが、プレートごとで傾きが少し違うと、安定して検出されるE4あるいはE5あたりで検量線が交差してしまうことで、GAPDH（私の用いている組織では18サイクル前後）との相対定量の結果が結構ずれてしまいます（同じcDNAを用いた場合-3.3と-3.8では2倍ほど差が出ます）。96wellしか使えないので、20サンプルあるとどうしても2プレーと用いないといけないので、そこが苦労したのですが、検量線の各濃度を4wellずつ使って、両プレートで微妙な差が極力出ないように検量線を修正してみることで、何とかなりそうです。念のためですが、条件は、各プレートで検量線（GFPのE5〜E1希釈）とNTCは必ず載せており、プレート間での差の指標として、同一のcDNAを両方のプレートで用い、検討しています（ということで、あっているでしょうか？）長々と書いてしまいすいません・・・。

(無題) 削除/引用 No.2302-5 - 2008/11/13 (木) 23:36:57 - AM > E1に引っ張られている すみません。私の使用しているソフトでは所謂「最小二乗法」で検量線が引かれるので、低コピーのスタンダードのCt値がばらつくと高コピーがある程度安定していても傾きがかなり変わってきてしまうのです。 ソフトによっては特殊な計算をしてカーブフィットするものもあると聞きました。そういうソフトであれば（その場合傾きというのか分かりませんが）、-4.3や-3.9という状況はもっと良くないかもしれませんね･･･。 ともあれ低コピー側のn数を増やしたらPCR効率80％以上に改善されたようなのでよかったです。 「機種を問わずおよそCt値で40サイクルがシングルコピーである(その逆でシングルコピーが40サイクルかも)」というのを聞いたことがあります。となるとばらつきが始まるE2が33サイクルくらい=100コピーオーダー ということになりばらつきは確率論的に妥当と言えるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2302-4 - 2008/11/13 (木) 17:21:53 - mom-a [直線性について] >GFPのE5〜E1は、プロットされた点はほぼ一直線上に並んでいてきれいな結果と思えるのですが 1)R2乗はいくつですか？ できれば>0.975は欲しいところです。低いようでしたら、思っているほど相関はよくありません。データがばらつく原因としては手技上の問題、PCR条件が良くない、などのほか、2)の問題も関係してきます。 2)濃度が低くなるにつれてカーブしていたりしませんか？ 低濃度では検出限界以下になっている（近づいている）という可能性があります。低い濃度を除いて検量線をかいたときに、R2乗が1.0に近づく、傾きが-3.3(効率約100%)に近づく、というのであれば、低濃度側を除いて検量線を作成しなおすべきです。 [直線の傾き=PCR効率について] >>傾きが安定せず、-4.3や-3.9 > >PCR効率にして70〜80％(100%=1ｻｲｸﾙで2倍に増幅と言う意味で)ということですので、あまり良くないですね。 検量線がR2乗＞0.98で引けているのであれば、バラツキがどうというより、PCRの効率が悪いということでしょう。私でしたらPCR効率80%以下でしたら、条件を検討し直します。これ以上検討の余地がないほど検討した、というのであればprimerを変えるなどの対策が必要と思います。 PCR効率の違いが影響しないようにわざわざ検量線を引いている、というのはもっともですが、極端に効率が悪い条件で実験するのは好ましくないと思います。 [検量線の安定性？について] >傾きが安定せず 傾きの数値の問題と「安定しない」のは別問題だと思いますが、同じ遺伝子を測定して-4.3だったり-3.9だったりする、ということですね？どういう条件で測定したもの同士を比較しているのでしょうか。私は同じ日に2plateでやってみたことがないのですが、日が違えば（マスターミックスのtube、lotが違ったりしますから、トピ主さんとは状況が違うかもしれませんが）0.2〜3は変動します。プレートごとに検量線を立てた方がいいのではないでしょうか。あまりにも毎回傾きが違うということであれば、やはりPCRの条件に問題があって、通常問題にならないようなことが原因で効率が違ってしまうのかもしれません。

ありがとうございます 削除/引用 No.2302-3 - 2008/11/13 (木) 17:00:44 - リアルタイム野郎 E1に引っ張られるといういみがよくわかりませんでしたが、Ct値のばらつきはE3からすこしばらつきが出始めて、E2では明らかにばらつき、E1は37サイクル〜Undetermiedという感じです。E5、E4はそれぞれ23、26サイクルぐらいで安定しており、E5はだいたいいつもUndeterminedなので、これらはいいのですが、E2はUndetermined〜33サイクルぐらいまでかなりばらついていました。ご指摘の通り、nを2から4に増やすと、slopeが3.7〜3.8で安定しました。とりあえず、SyberGreenがもったいないですが、これでやってみようと思います。もしよければ、E1に引っ張られているという意味を教えてもらえれば助かります。

(無題) 削除/引用 No.2302-2 - 2008/11/13 (木) 15:17:03 - AM >プロットされた点はほぼ一直線上に並んでいてきれいな 段階希釈は上手くできているようなので可能性は低いかもしれませんが 検量線サンプルの各濃度におけるCt値のばらつきはどうですか？ 一般的に高コピーは安定してPCRがかかりますが低コピー(E1ですかね)では当然ながらばらつきが生じると思います。 この傾きのばらつきがE1に引っ張られているものではないでしょうか。そうであれば低コピーのレンジはn数を増やすなどすれば傾きは安定してくるのではないでしょうか。 > 傾きが安定せず、-4.3や-3.9 PCR効率にして70〜80％(100%=1ｻｲｸﾙで2倍に増幅と言う意味で)という ことですので、あまり良くないですね。 最も濃い濃度の検量線のCt値(E5ということはイメージ的に20サイクル台のイメージありますが)もばらつくのであれば、そのスタンダード溶液が 劣化しつつあるのか、プライマーのデザインをもっとPCR効率のよいものに 変更したほうが近道かもしれないです。 ･･･と感じましたです。

検量線の傾きについて 削除/引用 No.2302-1 - 2008/11/12 (水) 10:30:51 - リアルタイム野郎 こんにちは。現在リアルタイムを行っているドクターです。 検量線についてなのですが、ある本で-3.2から-3.8の間の傾きで妥当性を評価し、これより大きく離れるものは再評価した方が良いと書いてあります。現在使っている検量線用の希釈（GFPのE5〜E1は、プロットされた点はほぼ一直線上に並んでいてきれいな結果と思えるのですが、傾きが安定せず、-4.3や-3.9といった数字が出ています。これは信頼できるということではないのでしょうか。私の施設では96Wellまでしか測れないので、前サンプルを測定するのに2プレート使わねばならず、傾きが少し変わると、サンプル間でのばらつきが大きくなってしまうので、どこまでを信頼するべきか悩んでいます。ちなみに、内因性コントロール（GAPDH）との比で発現量を計測しています。よろしくお願いします。

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