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(無題) 削除/引用 No.230-3 - 2007/09/24 (月) 12:49:08 - とりうし Erieさん 回答ありがとうございます。 やはり、プライマーの選定がおかしかったようです。 プライマーを他のものに変更したところ、でました。 RNAには問題はなかったようです。 GAPDHが出ないなんて想像もしていなかったもので、、。 ハウスキーピングが出ないのは心臓に悪いですね。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.230-2 - 2007/09/22 (土) 21:25:25 - Eire とりうしさん: お話から察すると、孵化後のニワトリ（ヒヨコあるいは成鳥）からのRNA抽出をされているのですよね。 私はニワトリ胚 (E16 位まで) しか扱ったことがないのですが、他の動物（といっても、これもマウスしか比べられるものはないのですが）と比べて特に違った扱いが必要ということはありませんでした。 GAPDH の RT-PCR での検出は私の以前の同僚がニワトリ胚でやっていた記憶がありますが、普通にできていた印象があります（残念ながら条件などは忘れてしまいました）。 プライマーはとりうしさんがご自身で設計されたのでしょうか、それとも過去の文献を参照されたのでしょうか。もし前者であればプライマーデザインの問題が考えられますので、ネットで検索するなりして「実績のある」プライマーを用いればよいのではないでしょうか。 （余談ですが、OD を計測して予想通りの濃度があったということで RNA の分解は考えにくそうですが、そんなに手間でもないでしょうから、ちゃっちゃと電気泳動で確かめた方が精神衛生上良いような気もします。） それでは、お役に立てば幸いです。

鶏からのＲＮＡ抽出がうまくいかない 削除/引用 No.230-1 - 2007/09/21 (金) 23:56:26 - とりうし 私は大学の学部生でＲＮＡを使った実験をしているものです。 いままで哺乳類の臓器組織からRNAを抽出して実験していたのですが、今回鶏の腎臓、気管などからRNAを抽出してRT-PCRを行いましたが、どうもうまくいきません。 実験条件 TRIzolに漬けてー80℃に保存していた腎臓、気管をホモジナイザーで破砕したのち、TRIzolのプロトコールに沿って抽出しました。 ホモジナイザーはサンプルごとに水で洗い、最後にTRIzolに漬けてから次のサンプルの破砕を行いました。 次にＯＤ260で濃度測定(濃度は十分でした)したのち、promegaのキットでcDNAを合成し、GAPDHでPCRを行ったところ全て(2臓器15サンプルずつ)ネガティブでした。 そこで試薬を全て新しいものにしてcDNA合成しなおしたりしましたがダメでした。 RT反応のポシコンはポジティブでした。 もしDEPC処理水などの基礎試薬や、ホモジナシザー等がRNaseに汚染されて場合このようなことが起こりうるでしょうか？ それとも鶏はRNAの失活が早いとか哺乳類とは違う特徴があるのでしょうか？ 正直今までほとんど失敗したことのないプロトコールだったので悩んでいます。 RNA電気泳動を行ってみようと思っていますが、その前に致命的な間違いがあればと思い質問させていただきました。 基本的過ぎて申し訳ありませんが、たいかめるべき点などあれば教えてください、よろしくお願いします。

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