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ありがとうございました 削除/引用 No.2299-18 - 2008/11/12 (水) 18:20:31 - みつや 短期間の間に数多くのサジェスチョンをいただき、 心より感謝いたします。 私一人では到底考えも付かなかった解釈の仕方を 教わり、大変参考になりました。 まだまだ初心者なものですから、用語一つを取り ましても十分理解できていないような状況ですが、 勉強しながらそれぞれの仮説について検証してみ たいと思います。 本当にありがとうございました。

CNV 削除/引用 No.2299-17 - 2008/11/12 (水) 12:31:12 - edu 適切なヒト材料を使って、実験が全てうまくいってるとしたら、copy number variation (CNV)に基づくものの可能性を考えるのが自然かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2299-16 - 2008/11/12 (水) 11:24:09 - おお >[Re:14] うううさんは書きました : > おおさん > > 培養細胞の場合は、極端な場合、細胞質分裂がうまくいかず > 多核になることはよくありますよね。NIH3T3なんかはよくみかけます。すぐ > 細胞の顔が悪くなる・・・。 > 癌組織からとってきた細胞は往々にして染色体の数がむちゃくちゃなことがおおいですし。 ですから、その染色体はもともとその細胞をアイソレートしたとき2本であって、 不死化などに伴って、染色体の本数にバリエーションが出てくるわけですよね。 ATTCなどではその平均染色体の数とかものせています。 で染色体がそのように異常な状態でも、もともとの由来が2本ですから 2種類の多型が検出できると考えたのですが。それ以外の多型がみれる とすれば、染色体間で組みかえが起こっているか、変異がのホットスポット で培養中におきたとかいうことを考えないといけないかもしれません。 でもコメントからするに 多型のところのバリエーションということのようなので、変異がはいった としては偶然すぎではないかとも思えるわけです。 RNAエディッティングの酵素はアデノシンデアミナーゼはDNAをターゲット にできるので、そのゲノム領域がそういう酵素のターゲットになってるかも とか、、、まぁ空想すると取り留めもありませんが。

(無題) 削除/引用 No.2299-15 - 2008/11/12 (水) 10:46:56 - AP >あと、この遺伝子のゲノムの配列を読んでみましたところ、イントロンが１カ所入っていることが分かっています。 これは、クローニングされたゲノムDNAを読んだのでしょうか、それともPCRしてダイレクトシークエンス？もし後者なら（これをやっていないなら一度試す価値はあると思います）、その中にも同じ塩基多型の兆候はありませんでしたか。また偽遺伝子のcDNAを引っかけているとしてもゲノムのPCRやシークエンスで兆候があるはず。クローニングされたゲノムを読んだという場合だと、もともと多型があって、そのクローンと、RT-PCRで見ているcDNAがもともと由来生物の多型を含んでいるという可能性はないでしょうか。 再現性の高い置換だから酵素のエラーでないとすると、もともとそういう配列の遺伝子があったと考えるのが妥当だと思います。材料生物のinsogenicityはどれほど保証されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2299-14 - 2008/11/12 (水) 10:43:58 - ううう おおさん 培養細胞の場合は、極端な場合、細胞質分裂がうまくいかず 多核になることはよくありますよね。NIH3T3なんかはよくみかけます。すぐ 細胞の顔が悪くなる・・・。 癌組織からとってきた細胞は往々にして染色体の数がむちゃくちゃなことがおおいですし。

(無題) 削除/引用 No.2299-13 - 2008/11/12 (水) 10:38:01 - Boston ＞おお様 発現している可能性は多いにあります。ランダムプライマーでは確実にcDNAを合成できますが、オリゴdT をRTに用いた場合も合成できるものでしょうか？ポリAはmRNAにのみついていると理解しています。詳しい方、教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.2299-12 - 2008/11/12 (水) 10:28:37 - おお >[Re:11] うううさんは書きました : > このcDNAはなに由来ですか？ > 染色体の数は2本づつの細胞からですか？ > 培養細胞では、割と2本づつではなくマルチゲノムのように > なっているものも多くありますよ。 > ん、でも由来は2本の染色体のどちらかですよね。 トランスロケーションが頻繁に起きていると言うことでしょうか

(無題) 削除/引用 No.2299-11 - 2008/11/12 (水) 10:17:32 - ううう このcDNAはなに由来ですか？ 染色体の数は2本づつの細胞からですか？ 培養細胞では、割と2本づつではなくマルチゲノムのように なっているものも多くありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2299-10 - 2008/11/12 (水) 09:05:48 - おお >[Re:8] Bostonさんは書きました : > シュード遺伝子の多くはイントロンを持ちません。なので、ゲノムDNA がコンタミした場合、仮にFwd と Rev プライマーを異なるエクソンにデザインしても、容易に検出できます。 横れすですが、発現している可能性(もちろんシュードなので タンパクはできない)はないでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2299-9 - 2008/11/12 (水) 09:02:56 - おお >[Re:6] hisiiさんは書きました : > オルタナティブスプライシングの可能性はどうでしょうか？ あ、そうそう。カッセットエクソンで若干違うだけのものが、 選択的スプライシングを受ける場合もあるか、、、 あとSMNはヒトでは2コピーあってORFの配列はほぼ一緒(イントロン領域も 非常によくにている)でPCRで分けれるプライマーがなかなかないようです。

補足です 削除/引用 No.2299-8 - 2008/11/12 (水) 08:59:30 - Boston 基本的なことですが、RT (-) のサンプルでもバンドがありますでしょうか？DNase 処理はされていますか？４ヶ所の他型と表現されているので、SNP のような点変異と解釈しています。シュード遺伝子は配列がオリジナルと非常に似ていますー当然ですが。シュード遺伝子の多くはイントロンを持ちません。なので、ゲノムDNA がコンタミした場合、仮にFwd と Rev プライマーを異なるエクソンにデザインしても、容易に検出できます。

(無題) 削除/引用 No.2299-7 - 2008/11/12 (水) 08:33:45 - おお まっ先に思いついたのがエディッテイングですが、、、 実際に怒るかどうか分からないのですがPCRの懸念として 考えていることがあります。 プライマーからの伸長の効率が何らかの理由で悪くて、 伸長反応中に途中までしか伸びなかったものが 変性し、違う(他のSNPsをもつ)テンプレートに 次にステップでアニーリングしてしまう可能性です。 解決方法に具体的になるかどうか分かりませんが、 考えられることとして、伸長反応時間を長めに取る。 PFUとTaqのミックスされた物を使い、伸長反応を 早める。酵素を若干多めにする。プライマー、 テンプレートを若干少なめに するなどでしょうか、、、、、 マンマルでもまれにトランススプライシングが おこるようです(おそらくスプライシングのエラー だと思いますが)。 あ、なるほど、、シュードジーン拾ってる可能性もありそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2299-6 - 2008/11/12 (水) 08:15:14 - hisii オルタナティブスプライシングの可能性はどうでしょうか？ 例えばACC1なんかは同じ塩基数でも私の知る限り6種類のバリアントがあります。 何か面白いことが起きてそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2299-5 - 2008/11/12 (水) 04:36:55 - Boston Pseudogenes?

補足します 削除/引用 No.2299-4 - 2008/11/11 (火) 22:00:23 - みつや 早速ご回答いただき、どうもありがとうございます。 一点補足させていただきますと、４カ所の多型は他のサンプルでも 共通して見つかっておりますので、cDNA合成やPCRの際に偶然生じた 変異とは考えていません。 よく分からないのは、それらがいろんな組み合わせで出現するとい うことです。これまでに他の遺伝子で同様の解析をしたことがあり ますが（PCR酵素は同じです）、多くても２通りの配列しか検出さ れませんでしたことから不思議に感じています。 あと、この遺伝子のゲノムの配列を読んでみましたところ、イント ロンが１カ所入っていることが分かっています。このことも何か関 係あるようにも思ったのですが、５通りの配列の原因にはなり得な いようにも思います。

(無題) 削除/引用 No.2299-3 - 2008/11/11 (火) 20:07:19 - T RNA editing が起きているとか

(無題) 削除/引用 No.2299-2 - 2008/11/11 (火) 19:30:33 - AP AmpliTaq Goldはproof-reading活性がなかったと思うので、PCRでmutationが入ってしまった可能性はあると思います。polymeraseが間違った塩基をを取り込んで、そのまま伸長が進むために塩基置換が起こります。 それと、実際そういう事例にあたったことは無いのですが、RNA polymeraseやreverse trascriptaseもproof-reading活性が無かったはずのので、原理的には、mRNA自体に、あるいは逆転写反応の段階で塩基置換が入る可能性もあります。 それにしても、頻度が高すぎかなあ。400 bpしかないのに4箇所も！それくらいの長さなら、proof-readingが無くても無傷であっておかしくないくらいです。 dNTP濃度が高すぎるとか、何段階もPCRを繰り返しているとか、mutationを誘発しやすいことはやってないですか。

シングルジーンから５通りのｃDNAができますか 削除/引用 No.2299-1 - 2008/11/11 (火) 19:05:58 - みつや ある遺伝子の一部（約400bp)をcDNAを鋳型に増幅し、ダイレクトシーケンスで配列を読んだところ、４箇所でヘテロのピークが検出されました。 そこで、PCR産物をTAクローニングし、いくつかのクローンの配列を読んでみたところ、４箇所の配列が様々に組み合わさった５通りの配列が検出されました。 この遺伝子はシングルジーンと考えられていますので、多くて２通りの配列しか検出されないと思っていました。 PCR段階の転写ミスか何かでありえない配列の増幅産物が出来上がることがある、というような話を聞いたことがあるのですが、今回はそのようなケースと考えるべきでしょうか。 PCR酵素はApplied Biosystems社のAmpliTaq Goldを使っています。 どうかご教示ください。

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