全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2288-18 - 2008/11/16 (日) 19:06:42 - 学生 ザンギ様 お返事ありがとうございます． ＞電気泳動の結果をみてから議論するのが生産的ではないでしょうか。 早速試してみたいと思います． 結果が出次第，ご報告させていただきます．

(無題) 削除/引用 No.2288-17 - 2008/11/16 (日) 19:00:33 - ザンギ いろいろ考えて検討されていらっしゃるようですが。。。 コメントされている皆さんが最初から指摘していることに対しては、答えてらっしゃらないように思えます。 端的にいえば、rRNAが分解してませんか？ おおさんもコメントされてますが、電気泳動してみれば分かることです。 rRNAは主要成分なので、分解していれば電気泳動でのバンドが変化するのが見えるはずです。 RNAの全体量が生体内で減少していたとしても、UV吸収で測定した結果に基づいてRNAを揃えて実験してるでしょうから、rRNA量は揃ってるはずですよね？ それなのに定量PCRでは18SrRNA量が減少しているように見えてしまうのは、rRNAが分解していているからではないですか？ 電気泳動の結果をみてから議論するのが生産的ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2288-16 - 2008/11/16 (日) 13:56:08 - 学生 おお様，AP様 お返事ありがとうございました，御礼を申し上げるのが遅くなりすみません． おお様のおっしゃる通り，ストレスで細胞が死んだのかもしれませんね． その結果，AP様のおっしゃるようにRNAの全体量が低下したと考えれば納得できます． ＞全体としてレベルが低くなっているなら、そういうのを補正するための内＞部標準ですから、18Sを内部標準するという選択はあっていいでしょう。 これが一番気になっていたことです．このように補正していいのかで悩んでいました．予備実験として，標的遺伝子のプライマーでリアルタイムPCRを行い１８Sで補正してみて結果を確認したいと思います． ＞この際、RI標識ヌクレオチドを入れて、逆転写効率を測ったらどうでしょ＞うか。白黒はっきりして、適切な対処法も見えてくるのではないでしょう＞か。cDNA libraryを作るときなど、ステップごとにどれくらいうまくいっ＞ているかをチェックするのに、よくやる方法です。 このように逆転写効率を測る方法もあるのですね．教えていただきありがとうございます．是非検討してみます．

(無題) 削除/引用 No.2288-15 - 2008/11/15 (土) 14:54:22 - AP いろいろややこしいことを言いましたが、整理すると、 検出される18Sのレベルが選択的に低くなっているのか、そうではなくて、すべてのRNAのレベルが一斉に低くなっていて、その現象の一つの現れてして18Sが低下しているのか、ということにつきると思います。 >しかし，アクチン，エロンゲーションファクター，ユビキチン等を内部標準遺伝子として試しましたが，１８S以上に処理区/対照区比が小さくなりました． ということから考えれば後者で、18S選択的に低下しているのではなく、おそらくRNA全体的に低く検出されるのだろうということになると思います。 どうしてそうなるかはおいといて、全体としてレベルが低くなっているなら、そういうのを補正するための内部標準ですから、18Sを内部標準するという選択はあっていいでしょう。 もし、18Sが選択的に低下しているなら、その現象自体はおもしろいですが、内部標準を求めているという当初の目的には不適当と言わざるを得ません。 >ご指摘いただきましたように，逆転写効率の変化を疑い，抽出方法を変えて検討もしましたが，やはりダメでした． 精製度を上げてみても、実際に逆転写効率をみているわけではないので、そこに問題がある可能性は否定できないと思います（実際、アッセイの結果でなんら問題がなさそうでも、逆転写効率が低いということはある）。 この際、RI標識ヌクレオチドを入れて、逆転写効率を測ったらどうでしょうか。白黒はっきりして、適切な対処法も見えてくるのではないでしょうか。cDNA libraryを作るときなど、ステップごとにどれくらいうまくいっているかをチェックするのに、よくやる方法です。

(無題) 削除/引用 No.2288-14 - 2008/11/15 (土) 14:08:11 - おお あ、ストレスで細胞死んでない?

(無題) 削除/引用 No.2288-13 - 2008/11/15 (土) 14:05:11 - おお 相変わらずネガティブな意見が続きますね。 でもそれぐらい疑われるような感じの現象です。 ただし、おかきになった要素からは否定のしようも 肯定のしようもありません。 ひとつだけ、まだ確認していなかったら ご確認ください。それぞれのサンプル(RNA)を 同じ量電気えいどうして、RTPCRに出てくるような けっかが見れるか。つまりリボソーまるRNAの減少が 見れるかです。 でこめんとは、18sRNAの減少に関して物が多いですが、 実際にはインターなるコントロールとして妥当なもの を探しているわけですよね。そういう意味では カナマイシン さんの文献は参考になりませんか? rRNAが動くととをしめすには、細胞数あるいは 1細胞中の総RNA量を示す尺度をみたいな物が必要だとかんがえれば 参考になることが書かれている可能性が大きくないでしょうか (私はまだ文献を確認してませんのでコメントできません)。 2つのサンプルで同じ細胞数から、RNAを取ればそれをベースに ある程度のことはいえると思いますし(多分抽出効率 のばらつきとかありますのでnが必要になるかもしれませんが) いろいろやりくりしていると結論が見えてくるような気もしますよ。 たとえば、RNAとDNAを分離せずに抽出し、ターゲットのpre-mRNAの長くない イントロンを挟んだ、PCRをすると、イントロンを内部標準として 使える可能性もありませんか?ゲルで電気えいどうすることが前提ですが。 ま、これは本気で樹立しないとできないと思いますが、、 で、状況からするのこの問題から長い間脱却できてないようですので、 もう少し多角的にすすめれないか、よく考えるべきです。 タンパクを見てみるとか、プロモーター活性を見れないかとか、マイクロアレーをつかってみるとか、、、 臭いものにふたをするようなやり方ですがpolyAを精製するとか、、、

(無題) 削除/引用 No.2288-12 - 2008/11/15 (土) 13:08:30 - 学生 ザンギ様 お返事ありがとうございます． ご指摘いただきましたように，逆転写効率の変化を疑い，抽出方法を変えて検討もしましたが，やはりダメでした．具体的には，植物では多糖類やポリフェノール類の混入が阻害物質として働くようなので，これらを除去する方法でRNAを抽出し，リアルタイムPCRを行いました．多糖類の除去にはインビトロジェンの抽出キットを使い検討しました．ポリフェノール類の除去にはキアゲンの抽出キットと高分子のPEG20000を組み合わせて検討しました．また，抽出したRNAをキアゲンのキットでさらにクリーンアップするという方法も検討しましたが，いずれも上手くいきませんでした．キアゲンのキット単体で抽出した場合と様々な抽出方法を比較しても，純度(260/280 or 230)が劇的に向上するとういこともありませんでしたので，多糖類やポリフェノール類の影響ではなかったというふうに判断しています． ご提案頂きました方法についても検討してみたいと思います．ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.2288-11 - 2008/11/15 (土) 00:47:56 - ザンギ ご存じと思いますが、rRNAは全RNA量の90%以上になるのが普通の生理状態です。 ですから通常は、18S等のrRNAを内部標準とした解析の場合にはトータルRNAがそろってることを確認するということに近似します。 トータルRNA量をそろえて定量PCRに供しているのに、18S量が変動するということは逆転写の効率が変化していると解釈するのが妥当ではないでしょうか。 rRNAの逆転写はおもにランダムオリゴでプライミングされると思いますが、プライミングサイトはそんなにバリエーションがあるものではないように感じています。 観察された見かけ上の18Sの減少は分子の断片化を意味しているように思われます。 サイトを変えて定量PCRしてみると変動しないケースも見つかるのではないでしょうか。 そうすることによって、ちゃんとRNA量が揃ってることを示唆できるので、議論されているようなrRNAの生理的な役割も説明できるようになるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2288-10 - 2008/11/14 (金) 18:23:01 - AP このようなケースで、18S内部対照として使えるか使えないかという問題は、他の方にお任せします。 >ハウスキーピング遺伝子を１８Sにしているため，１８S/ハウスキーピング比については分かりません．しかし，アクチン，エロンゲーションファクター，ユビキチン等を内部標準遺伝子として試しましたが，１８S以上に処理区/対照区比が小さくなりました． まさにそういうことを聞きたかったのですが、処理区ではそれらの（conctituiveと考えられる）遺伝子のRNA量も減っていたということですね。 そこで対照区と処理区でそれぞれ（アクチンなど）/（18S）比率を取るとどうなりますかというところに興味がありました。 >対照区，処理区ともに同じサンプルからRNA抽出を３回行い，ｃDNA合成，リアルタイムPCRの一連の実験を以前行い，テクニックのばらつきによるものではないことは確認しています．また，同一区内から異なる３サンプルについてRNA抽出，ｃDNA合成，リアルタイムPCRを行いました．その結果，やはり対照区の相対値が処理区より３〜５倍程度高くなることを確認しています． 小うるさいことを言うと、異なるサンプルで再現性があるというのは第一関門ですが、それをクリアしてもまだ、材料の生理状態によって固有の問題が、RNAの品質をばらつかせている可能性はあると思います。 たとえば私たちの分野で、発生ステージの異なるサンプルをとって比較したとき、定量精度の範囲でRNAをそろえ、同じ系で処理しているのに、あるステージだけどうしても、いつも逆転写効率が低いとか、内部対照のシグナルが弱いとかいうことがあります。生理状態が違うため夾雑物の組成や量が違うとか、RNAの分解が盛んなステージでintactなRNAが少なくなっているとか、材料固有の問題があるようです。 単にそのような理由で、（RNA定量の結果にかかわらず）reverse transcription competentな総RNA量が一斉に減少しているとかreverse transcription効率が低くなっていて、18Sのレベルに開きがあるなら、むしろ18Sを採用して、それでnormalizeするのは理にかなっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.2288-9 - 2008/11/14 (金) 15:30:30 - 学生 AP様 早速のお返事ありがとうございます． ＞1) 独立に精製をおこなった、バッチの異なるRNAサンプルでも再現性がある現象のでしょうか。 対照区，処理区ともに同じサンプルからRNA抽出を３回行い，ｃDNA合成，リアルタイムPCRの一連の実験を以前行い，テクニックのばらつきによるものではないことは確認しています．また，同一区内から異なる３サンプルについてRNA抽出，ｃDNA合成，リアルタイムPCRを行いました．その結果，やはり対照区の相対値が処理区より３〜５倍程度高くなることを確認しています． ＞2) ハウスキーピング遺伝子などを定量したとき18S RNAとの比率はどうなるでしょうか。この比率でみると、やはり（18S）/（ハウスキーピング）の値が小さいでしょうか。実は、ほぼ一定だということはないでしょうか。 ハウスキーピング遺伝子を１８Sにしているため，１８S/ハウスキーピング比については分かりません．しかし，アクチン，エロンゲーションファクター，ユビキチン等を内部標準遺伝子として試しましたが，１８S以上に処理区/対照区比が小さくなりました． やはり，水ストレス処理により１８Sが動いたと判断せざるを得ないのでしょうか？もしその場合，１８Sを内部標準遺伝子として使い，標的遺伝子を補正するという手法は妥当でしょうか？いつも質問ばかりですみません．よろしくお願い致します．

(無題) 削除/引用 No.2288-8 - 2008/11/14 (金) 14:51:42 - AP RNAサンプルに対して、同じスケールで逆転写してリアルタイムPCRして、18S RNAについてのみ定量したら、そうなったということですね。 逆転写効率はRNAサンプルごと、チューブごとにかなり振れ（RNAの純度や分解の程度のバラツキ、RNA定量の誤差、ピペッティングの誤差などで）、同じスケールで反応しても、2〜3倍あるいはそれ以上のバラツキはまれではなりません。それを補正するためにこその内部標準です（あんまりバラツキが大きいようだと実験系や手技の不備が疑われ、補正した値を信じていいかどうかという問題になることはあると思いますが）。そこを押さえた上で、 1) 独立に精製をおこなった、バッチの異なるRNAサンプルでも再現性がある現象のでしょうか。 2) ハウスキーピング遺伝子などを定量したとき18S RNAとの比率はどうなるでしょうか。この比率でみると、やはり（18S）/（ハウスキーピング）の値が小さいでしょうか。実は、ほぼ一定だということはないでしょうか。 >以前cellにあった、rRNA（おそらく)が絶食などのストレス時に転写抑制がかかり、それがepigeneで制御されているという報告読んだことがあります。 おもしろい現象がありますね。リボゾームの豊富さは細胞種ごとに違うし、卵形成のときにrDNAを増幅してまでリボゾームを増やす種があったりということはよく知られていますが、環境に対する適応的、合目的的調節という点で興味深いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2288-7 - 2008/11/14 (金) 11:10:53 - 学生 皆様お返事ありがとうございました．お礼を差し上げるのが遅くなりすみません． 私の行っている実験系についてですが，two-stepのリアルタイムPCRで遺伝子の発現解析を行っています．キアゲンのキットでトータルRNAを抽出した後，ｃDNA合成時に0.1μg/μlになるようにRNAの量を調整しています．その後，リアルタイムPCRを行っています．内部標準遺伝子は18SrRNAです．検量線の傾きと増幅効率はそれぞれ許容範囲に収まっており，プライマーがあっていない，あるいは反応時間や温度が合っていないという可能性はないかと思います．水ストレスを与えた処理区の18SのCt値が対照区の18SのCt値に比べ，2以上異なるため相対量が4倍以上異なると判断しています．抽出したRNAをキアゲンのキットでクリーンアップすると，処理区の１８SのCt値が対照区のCt値に近づきましたが，それでも3倍程度の差があります．あまり動かないとされている１８Sにこのような大きな差が出たので，疑問に思い質問させていただきました．キットを変えてみたり，抽出方法を色々試したりしていますが，ほぼ同様の結果になります．１８Sを内部標準として使わないほうが良いと判断すべきなのでしょうか？かれこれ半年ほどこの問題に取り組んでいますが，なかなか解決方法が見当たらず先に進んでいません．ご意見をいただけると助かります．よろしくお願い致します．

それです。 削除/引用 No.2288-6 - 2008/11/13 (木) 16:25:06 - fish 核内転写関連コンプレックスをいろいろとられていました。 今回のと関係あるかはわかりませんが。 もちろんいい仕事だと思います。 ただ、一番最初に、飢餓でrRNAの合成が抑制される現象をみつけて、 この現象がエネルギー節約を意味するということを一番初めに 見出された研究者は、この学生さんと同じ感覚だったのかもしれませんね。 当時も、アーティファクトではないかと延々、 validateされたんでしょうね。 変な現象を見つけた時に、それをどう扱うかは重要なセンス なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2288-5 - 2008/11/12 (水) 20:24:10 - カナマイシン fish様のおっしゃる論文はこれ↓ですかね。筑波の先生でした。 ちょうど最近読んで、同じ日本人の仕事としてとても嬉しかったので記憶しています。 実際、非常に面白い話だと思います。 …今回のトピック主さんの実験でほんとに有意に18Sが下がっているのかは 皆様がおっしゃるようもちろん慎重な吟味の余地があると思います。 それは別として。 Murayama A, Ohmori K, Fujimura A, Minami H, Yasuzawa-Tanaka K, Kuroda T, Oie S, Daitoku H, Okuwaki M, Nagata K, Fukamizu A, Kimura K, Shimizu T, Yanagisawa J. Epigenetic control of rDNA loci in response to intracellular energy status. Cell. 2008 May 16;133(4):627-39. PMID: 18485871

(無題) 削除/引用 No.2288-4 - 2008/11/12 (水) 19:58:16 - fish 他の方も書かれておりますが、dataが妥当であるとういうならば、 以前cellにあった、rRNA（おそらく)が絶食などのストレス時に転写抑制が かかり、それがepigeneで制御されているという報告読んだことがあります。 rRNA合成はその膨大な量の為、エネルギーを多く消費するので、 飢餓時には真っ先に、えねるぎー節約のために抑制するといったものだったと思います。(間違ってたらすみません) 確か筑波の先生でした。

(無題) 削除/引用 No.2288-3 - 2008/11/12 (水) 19:53:08 - おお 可能性は否定しませんが、慎重に判断してください。 実験系としてそれが本当にいえているか、 いえないけどその傾向がありそうなら、 どういう実験系がべすとか、、、、、 rRNAなので、まずは翻訳が機能として 挙げられると思います。そのほかについては PUBMEDで調べられると言いかと、、、、 特にプロモーターの解析などが わかり易いかもしれません。 ほかの質問にここの回答してました、、、 折角書いたので投稿しておきます。

(無題) 削除/引用 No.2288-2 - 2008/11/10 (月) 22:09:49 - AP >18Sの発現量がストレス区で３〜５倍程度対照区に比べて発現量が低下します。 内部標準自体が18Sなのに、どうして発現量が低下したとわかるのでしょうか。 実際に、生理的な発現量の低下が起こっている可能性は否定しませんが、それについてまじめに考察するには、前提（実験方法とそう判断した根拠）があやういです。

18SrRNAの働き 削除/引用 No.2288-1 - 2008/11/10 (月) 19:39:03 - 学生 私は、水ストレスを与えた時の植物の遺伝子発現の解析を行っています。 実験をしながら疑問に思ったことがありまして質問させていただいております。 内部標準遺伝子として、18S rRNAを使っていますが、18Sの発現量がストレス区で３〜５倍程度対照区に比べて発現量が低下します。そこで、18Sの働きについて理解できれば、この原因が分かるのではないかと思いトピックを立てさせていただきました。ご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけないでしょうか？

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---