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(無題) 削除/引用 No.2284-3 - 2008/11/11 (火) 15:43:20 - in situ 自分はDNAプローブは使ったことがないのですが、RI, DIG（ビオチン）, 直接蛍光標識の特徴を書いてみます。 ◇RI 　○感度がよい 　×多重染色ができない 　×細胞内局在を見るのには不向き ◇DIG（ビオチン） 　○二次抗体などにより蛍光検出、AP検出など様々なプロトコルに応用可能 　○酵素、二次抗体による増幅ができるので、検出感度もそれなりに高い 　○多重染色可能（ただし、せいぜい3色まで） 　×ビオチンはバックグラウンドが高く、特別なブロッキングが必要 ◇直接蛍光標識 　○多重染色可能 　○二次抗体などを使う必要がないためプロトコルが簡便 　×感度が低い プローブのラベリングはAPさまが挙げておられる方法の他に、invitrogenからULYSISという標識キットも出ています。 原理としては、グアニンに直接結合するようです。

(無題) 削除/引用 No.2284-2 - 2008/11/11 (火) 13:35:31 - AP Rocheでも、FITC標識やローダミン標識用のヌクレオチドを販売していますし、ISHのプロトコールも出していますから、Cy3で出来ないということはないでしょう。Cy3ヌクレオチドはGEなどから販売されているのを使えばいいのでは。 DNAプローブなら、random primed, PCR, nick-translationなどで内部標識ができるでしょう。 ただ、直接蛍光標識プローブは染色体FISHでは一般的ですが、細胞質RNAのISHではそうでもないですね（わたしもやったことがない）。かなり材料を選ぶのかも（酵素による増幅がかからない分、ターゲットRNAの発現量が多くないと難しいとか）。FITC標識の場合は直接蛍光法で見えない場合は、標識anti-FITCを使って間接法で増幅するなんてこともやるようですが。

DNAプローブの蛍光ラベル 削除/引用 No.2284-1 - 2008/11/10 (月) 17:19:49 - yashy いつも参考にさせていただいています。 in situ hybridizationに使用するDNAプローブについて教えて下さい。 DNAプローブをCy3でラベルしてin situ hybridizationをやってみたいと考えているのですが、Cy3ラベルしたDNAプローブを購入するしかないのでしょうか？ 可能ならばCy3ラベルのdATPやdCTPなどでプローブをラベルしたいと考えているのですが、どういった方法が一般的でしょうか？ 自分でもいろいろ調べているのですが、マイクロアレイの時のcDNAにラベルするキットの説明ばかり引っかかってきていまいちピンと来ていません。 参考になるサイトとかでも良いので、ぜひ教えてください。 また、RIやDIGと比べたときのCy3など蛍光ラベルの感度や使いやすさなどについても教えていただけると幸いです。 お願いします。

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