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(無題) 削除/引用 No.228-5 - 2007/09/22 (土) 09:58:11 - aa 精製できたGST融合タンパク質の量というか濃度は適当に濃いのですか？CBBでなく、銀染色で検出しているところが、オヤッて感じです。0.1mg/ml以上あるのだと考えてよろしいのでしょうか？薄いタンパクは、チューブ壁への吸着で全てなくなる可能性もあります。 そうでないとすると、脱塩カラムから溶出できていないかんじですね。 シリンジカラムが手製でしたら、 １）カラム底のフリットにタンパクが吸着している。 ２）脱塩条件でタンパク質が不溶化する。 ３）タンパクがそもそも不溶化している。（これは、なしということですね） ４）タンパクがデキストラン結合タンパク質 くらいしか思いつきません。 脱塩カラムの時の注意点は、 １）サンプルを丁寧に添加する。サンプル量が0.5mlであれば、0.1mlずつゲル表面を乱さないように、吸い込ませるように添加する。 ２）溶出液を添加する時も、最初の1mlは、例えば0.2mlずつ吸い込ませるように添加する。 くらいでしょうか。 ３）0.5mlのサンプルだったら、0.5mlずつ分画する方がよいかもしれません。 ４）平衡化緩衝液の塩濃度を0.3-0.5M程度に上げると良い結果をもたらすこともあります。 透析について判らないとのことでしたら、ピアスの透析セルを使用されるのが手っ取り早いかとおもいます。

ありがとうございます 削除/引用 No.228-4 - 2007/09/21 (金) 20:22:53 - GST １）脱塩カラムの体積は幾らでしょうか？文章から推察すると5mlと考えてよいのでしょうか？ ＞5mL。 ２）脱塩カラムは、PBSで平衡化してあるのですね？ ＞平衡化しています。 ３）グルタチオンセファロースから溶出する時の、pHは適切ですか？グルタチオンは、予想外にpHが低くなることがあり、pH低下で融合タンパク質が溶出していることもあります。 ＞10x pH7.4を十倍希釈して使っています。一応測ってみます。 ４）精製したGST-融合タンパク質は、脱塩する前の条件で可溶性でしょうか？ ＞可溶性です。 難しいことを考えないで、取り敢えず透析が良いのではないでしょうか？ 何か良いプロトコールをお持ちでしたら教えて頂きますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.228-3 - 2007/09/21 (金) 19:30:31 - aa １）脱塩カラムの体積は幾らでしょうか？文章から推察すると5mlと考えてよいのでしょうか？ ２）脱塩カラムは、PBSで平衡化してあるのですね？ ３）グルタチオンセファロースから溶出する時の、pHは適切ですか？グルタチオンは、予想外にpHが低くなることがあり、pH低下で融合タンパク質が溶出していることもあります。 ４）精製したGST-融合タンパク質は、脱塩する前の条件で可溶性でしょうか？ 難しいことを考えないで、取り敢えず透析が良いのではないでしょうか？

訂正 削除/引用 No.228-2 - 2007/09/21 (金) 17:10:52 - GST 訂正します。お世話になります。GST融合タンパクを精製しています。グルタチオンビーズで精製後にグルタチオンの除去を脱塩カラムでシリンジを用いて行っているのですがsample 0.5mL（溶媒ＰＢＳ）+ elution 1mL 6回で溶出したところ、全てのフラクションで銀染色検出できませんせした。精製前は確認できております。精製後分子量３００ほどの化合物のバインディングアッセイに用いるのでなるべくグルタチオンの影響を減らしたいのですが、何かうまい精製の仕方はありますでしょうか？やはりシリンジよりHPLCを使った方がいいのでしょうか？

GST 融合タンパクの精製について 削除/引用 No.228-1 - 2007/09/21 (金) 17:08:03 - GST お世話になります。GST融合タンパクを精製しています。グルタチオンビーズで精製後にグルタチオンの除去を脱塩カラムでシリンジを用いて行っているのですがsample 0.5mL（溶媒ＰＢＳ）+ elution 1mL 6回で溶出したところ、。精製後分子量３００ほどの化合物のバインディングアッセイに用いるのでなるべくグルタチオンの影響を減らしたいのですが、何かうまい精製の仕方はありますでしょうか？やはりシリンジよりHPLCを使った方がいいのでしょうか？

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