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(無題) 削除/引用 No.2278-18 - 2008/11/13 (木) 21:42:53 - コンストラクト初心者+ みなさま、更なるアドバイス本当にありがとうございます。 今回、２週間ぶりにうまくplasmidを取る事ができました。 これはすべてここでいただいたアドバイスによるものです、本当にありがとうございました（泣） ここのトピックでCaPさんがおっしゃった「mix well」という言葉に本当に驚かされました。 gently invertを私はしていましたが、これは静かにゆっくり4-6回ほど転倒させるやり方でこれまで行ってきました。が、今回、しっかり転倒させました。 すると何もかもうまくいっていたときと同じに戻りました。 みなさまのP2とP3の操作がおかしいという指摘通りでした。 本当にありがとうございました。 おおさん >QIAGENのミニプレップきっとは、トランスフェクションなどを考慮してませんので かなりDNA溶液中にLPSが存在するようです。 とても貴重な情報ありがとうございました。 みなさま、今後ともどうぞよろしくお願いいたしますm(__)m

(無題) 削除/引用 No.2278-17 - 2008/11/13 (木) 05:22:55 - おお >[Re:13] コンストラクト初心者+ さんは書きました : > ただ、T大学の某labのHPに載っているプロトコール集にはP3添加して遠心する前にクロロホルムを加えて激しく転倒すると記載されていました。 > > クロロホルムを添加するやり方で改善が期待できそうでしょうか。 > いや、それ以前の問題だと思います。 クロロフォルムは白い浮遊物がみられ、取り除けない時有効だと思います。 昔はコーヒーフィルターのようなものでこしたりしていたのでは と思いますが、、、 バッファーやスケールなどの見直しか、 自家製バッファーでアルカリリシス法を行い、 うまくいってそうならカラムに持っていくか ミニプレップはきっとをお使いですか? QIAGENのミニプレップきっとは、トランスフェクションなどを考慮してませんので かなりDNA溶液中にLPSが存在するようです。 いずれにしても、さらに精製が必要な気がします。

(無題) 削除/引用 No.2278-16 - 2008/11/13 (木) 04:23:45 - midiprep? > このベクターにインサートを入れてmidiprepしたときには４００ｍｌのmidi cultureから300-500 ugものプラスミドが取れているのでベクター自体やculture条件、midiprep操作などは問題ないかと。。 この培養液量ってキアゲンのMaxiprepのサイズですよね？それともMidiprepで4本以上に分けているのですか？ おそらくですが、溶菌不足の様な気がします。400mlのcultureでしたら各bufferは最低10mlだと思います。また、マニュアルでは二倍の20mlまで上げられると書いてあります。 あと、P2のSDSが析出していませんか？また、蓋をしっかりしなかったため、pHが酸性に寄っている可能性もあると思います。 菌体の量が多いと、培地を持ち込み易いので、PBSで一度洗うのもいいかもしれません。

混和がうまく行ってないのでは？ 削除/引用 No.2278-15 - 2008/11/13 (木) 03:52:37 - CaP 他の方が指摘されているようにP2での溶解、P3での中和が完全になされていない印象を受けます。 素朴な疑問なのですが、お使いのQIAGENのキットのP2とP3にはLyseBlueなる溶解を可視化してくれる試薬が足されていない物なのでしょうか? これが入っていれば少なくとも色の変化で溶解と中和がある程度は見て分かると思います。わざわざgently invertと書いておられるのであまりちゃんと混和されていないのでは、と推察します。 以前同僚だった人が初心者にはとにかく"mix well"と言っていました。激しく振る必要はないと思いますが、しっかりと混ぜるコトは必要だと思います。 あと、P2およびP3を添加する際の容器は何でしょう? P3を入れて満タンになるような大きさの容器だとうまく混和できていないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2278-14 - 2008/11/13 (木) 02:49:50 - 銅羅 midi culture（+大腸菌）の問題とキットの問題を分けたほうがよいような気がするので、miniprepで取れているとのことですのでmidi cultureから1 mLなりをminiprepしてplasmidが取れるかどうか確認されたらどうでしょうか（今のものにあるかどうかわかりませんが昔のQiagenのマニュアルには各プロセスで少量菌体を取っておき別にチェックしたら、という記述があったように記憶しています）。 感覚的には抗生物質-大腸菌間の問題のような気がするので、Aさんのminiprep多本数作戦あるいは多数のmini cultureをあわせてmidiprepでとる、が速いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2278-13 - 2008/11/13 (木) 01:26:14 - コンストラクト初心者+ おおさん コメントありがとうございます。 manualを読んでみましたが、P3添加して遠心後にイソプロは加えないようです。 ただ、T大学の某labのHPに載っているプロトコール集にはP3添加して遠心する前にクロロホルムを加えて激しく転倒すると記載されていました。 クロロホルムを添加するやり方で改善が期待できそうでしょうか。 APさん コメントありがとうございます。 酵母などの可能性を考え、再度LA plateからシングルコロニーを拾っても結果plasmidは取れなかったので、酵母などのコンタミではないだろうと考えたいです。 どうしたものか… とりあえず、今使用してるkitがちゃんとworkするのか、につきlabのメンバーに聞いてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2278-12 - 2008/11/12 (水) 20:34:21 - AP コンタミした真菌類か何かを殖やしているのかもしれません。 以前、グリセロールストックをプレートに起こして培養、プラスミド精製をしたとき、培養液は十分濁って、菌量も十分ありそうなのにプラスミドがとれないということがありました。そういえば、濁り方も遅かったし、菌体ペレットもなんだか様子が違っていたな（ちょっとぬめっとした感じで、妙に崩れやすかったり）と思い当たって、どうやら何か別のものをふやしたらしいということになったのですが。

(無題) 削除/引用 No.2278-11 - 2008/11/12 (水) 20:05:20 - おお >[Re:10] コンストラクト初心者+さんは書きました : > おおさん > > えっ、それはしていませんでした。 > カラムにかける前に上清をイソプロ沈するやり方が一般的なのでしょうか？ > 質問ばかりですみません。。 > マニュアルをお読みください。長い間使ってませんから 正確に覚えてないです。 ただQIAGENのカラムはイオン交換(DEAE)だったと思うので、 ん、でも300mMクラいの塩だったらDNAつきますね、、、、 すいません独り言がおおすぎます。

(無題) 削除/引用 No.2278-10 - 2008/11/12 (水) 19:50:52 - コンストラクト初心者+ おおさん アドバイスありがとうございます。 僕もP2, P3が気になります。 >ほかの方は同じボトルからバッファーを取って使ってますか? 確認してみます。 それと、P3を加えた後の遠心で、pelletができず、ドロっとした白く変性したものができる場合が多いです。うまくplasmidが取れる時にはいつもこのドロっとしたものはできず、薄っぺらいpelletが出来ます。このドロっとした分厚いpelletが出来る場合には大抵うまくplasmidが取れる事はないように思います。。 もう少しsuspensionとP1〜P3のvolumeを多くしてみます。 >遠心後うわずみにプラスミドだけが残っている状態になるはずです。 >このうわずみをイソプロとかで沈殿してリカバーしてカラムに のせるのだと思いますが、、、、 えっ、それはしていませんでした。 カラムにかける前に上清をイソプロ沈するやり方が一般的なのでしょうか？ 質問ばかりですみません。。 Aさん >ベクターがどれくらい必要なのかわかりませんがもしminiprepでうまくいくことがわかっているクローンがあるのならそれを使って20なり30なminiprepしてとりあえず急場を凌ぐという手もあります。 なるほど、考えた事はありましたが、実際そうやってる方の意見を聞けたのは初めてです。 実際、miniprepとmidiprepとで、plasmidのpurityについて理解が足りていません。 もしminiprepを大量にやって、そこから実験に必要なplasmidを得られれば今回のような場合、手っ取り早いかもしれませんね。そのやり方できれいなplasmidが得られるのでしょうか？炎症系の実験を行っているので、miniprep由来がpurityが低く、LPSがコンタミしていると実験に不都合が懸念されますね。 いくつかmanualを読み直しています。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2278-9 - 2008/11/12 (水) 17:28:04 - A ベクターがどれくらい必要なのかわかりませんがもしminiprepでうまくいくことがわかっているクローンがあるのならそれを使って20なり30なminiprepしてとりあえず急場を凌ぐという手もあります。私はそれで乗り切ったことが一度あります。 当然カルチャーには抗生剤を入れているでしょうからプラスミドを持っていない大腸菌は増えないはずですよね？念のため今使っているグリセロールストックをいろいろな抗生剤を含むプレートに引きなおしてみては如何ですか？アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどに引きなおして今使っている抗生剤以外のプレートでも生えてくるようであれば酵母の様な大腸菌以外の何かがコンタミしていることがわかるでしょうし。可能性が少ないとは思いますが念のためです。 ホストのDH5aはキットとの相性もいいはずなので問題ないでしょうね。 ここまでくると細かいところまで確認しないと何がうまくいっていないのか確認するのは難しくなってきます。後はまず再度マニュアルを細部まで読み直して気にかかるところが確認した上で同じ研究室でも周りの研究室でもいいのでこの辺りの実験に慣れた人にコンストラクト初心者+ さんの操作に問題がないか見てもらうしかないように思います。誰か心当たりはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2278-8 - 2008/11/12 (水) 16:58:57 - おお >[Re:7] コンストラクト初心者+さんは書きました : > １　12時間培養した大腸菌を8000 rpm, 8 min, 4℃ > ２　decantation後、cold P1 10 ml (6 mlでは不十分そうだったので10 ml加えています), pipatting > ３　遠心管に移し、P2 10 ml, gently invert, 室温, 5 min > ４　P3 10 ml, gently invert, on ice, 15 min > ５　12000 rpm, 30 min, 4 ℃ > > その後、遠心管を見ると二層に分離しています。 > 下層は透明です。この部分を回収してカラムにかけてもplasmidは取れませんでした。 > 上層は半透明の薄黄色をしています。この部分をカラムにかけるとカラムが詰まります。おそらく粘性があるんだと思います。 上層の粘性はもしかしたら大腸菌のゲノムのような気がします。 と言う事は、変性(きっとは使ってないのではっきりといえませんが多分P2) と中和(P3)の過程がうまくいってないようなきがします。 ほかの方は同じボトルからバッファーを取って使ってますか? 変性の過程は0.2NNaOHとSDSかそれに準ずるもので、ここで 非常に粘り気のある溶液になります。 中和の過程でこの粘性の原因になるゲノムが沈殿するため 遠心後うわずみにプラスミドだけが残っている状態になるはずです。 P3が少ないのかな、、、 このうわずみをイソプロとかで沈殿してリカバーしてカラムに のせるのだと思いますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2278-7 - 2008/11/12 (水) 16:27:31 - コンストラクト初心者+ Aさん、おおさん 返信遅れて申し訳ありません。 大腸菌はDH5アルファを用いております。 insertを入れた物ではきちんと取れているので、vectorの問題ではないと考えています。 昨日、high copyと自分で確認した大腸菌のクローンをmidiprepしましたが、結果、plasmidは取れませんでした。イソプロを0.7倍量加えて、-20℃, 2時間後に遠心してもpelletは見えませんでした。吸光度も測定できませんでした。 抽出する過程で慎重に自分の操作を確認しているとおかしい事に気づきました。 簡単に操作の手順を書いてみます。 １　12時間培養した大腸菌を8000 rpm, 8 min, 4℃ ２　decantation後、cold P1 10 ml (6 mlでは不十分そうだったので10 ml加えています), pipatting ３　遠心管に移し、P2 10 ml, gently invert, 室温, 5 min ４　P3 10 ml, gently invert, on ice, 15 min ５　12000 rpm, 30 min, 4 ℃ その後、遠心管を見ると二層に分離しています。 下層は透明です。この部分を回収してカラムにかけてもplasmidは取れませんでした。 上層は半透明の薄黄色をしています。この部分をカラムにかけるとカラムが詰まります。おそらく粘性があるんだと思います。 中間層はモヤモヤしています。吸うと半透明で白いです。 このような二層分離は以前はありませんでした。。 なぜこうなったのか、未だにわかりません。 抽出kitはquiagenのmidi prep用のP1 (RNase入り)、P2、P3、QBT、QC、QF buffer（elutionに用いる直前に加温しています）を使用しています。自作の物ではありません。 周りの者は同じkitを用いてうまく言っております。 二層分離する意味はよくわかりません。 個人的には十分にP1でresuspendさせていないだけかと思い、かなりpipettingするようにしているのですが、改善に兆しを感じる事ができません。 どうかご教示いただけないでしょうか？ P1やP2やP3 bufferは10 mlでそれぞれ用いているので、十分だと思うのですが。。 あるいは10 mlが多すぎるのでしょうか？ 困っています。。どうか皆様の貴重な意見をお願いいたします。m(_ _)m

(無題) 削除/引用 No.2278-6 - 2008/11/10 (月) 08:39:15 - おお >[Re:1] コンストラクト初心者+さんは書きました : > つまり、もともとはクローンだったはずの大腸菌がグリセロールストックから解凍したらプラスミドのコピー数が減ってしまうことなど。。 グリセロールストックなら、落ちていく可能せいはありますね。 やはり、線画培養していいクローンを拾うべきだったのではないでしょか。 グリセロールストックのそのような可能せいは過去のとぴ(特に タンパク発現系で)何度かありました。タンパク発現が落ちるということです から、プラスミドが落ちるということですよね。 原因については詳しく分からないのですが、そう言う事が 結構おきます。

(無題) 削除/引用 No.2278-5 - 2008/11/09 (日) 23:48:32 - A 連投すいません。 下の書き込みで言いたかったのはもし該当の大腸菌を現在使用しているのであれば以前と今回のうまくいった10回中の1回はたまたまうまくいっただけという可能性も考えられるので大腸菌の種類を代えたら問題解決ができるかもしれないと言うことです。

(無題) 削除/引用 No.2278-4 - 2008/11/09 (日) 23:32:12 - A 何らかの理由でプラスミドが安定しないのでしょか？私自身も経験したことはないですね。 ひとつ気になるのは形質転換した大腸菌の種類は何ですか？キアゲンのmidiprepキットを使われて言うということですからマニュアルに書いてあると思いますが大腸菌の種類（TG1やJM100など）によってはcarbohydrateが多量に発現されプレップしづらく、収量が代わってきたりします。マニュアルによるとその場合には使用するP1、P2、P3の量を倍にする（液の比は変えない）と対処できるようです。加えてJM101,JM110,HB101などはEndonuclease活性が他に比べ高いとのことです。私が見ているマニュアルはQIAGEN Plasmid Purification Handbook Third Edition June2005ですがその辺りについては11ページの「Host Strains」の項目に書かれています。Editionが異なっても同じ情報は書かれていると思いますので確認してみてください。 あともし大腸菌を代えるのであればXL1-Blueをお勧めします。ご存知のとおりダブリングタイムが約40分と長いのですが経験的に毎回きれいなプラスミドが取れてくる印象があります。

(無題) 削除/引用 No.2278-3 - 2008/11/09 (日) 19:52:48 - コンストラクト初心者＋ >おかしいですね。 やはりそういう感覚なんですね。 ○ベクターの骨格は何でしょうか？ ベクターはpMXsのレトロウイルスベクターです。 このベクターにインサートを入れてmidiprepしたときには４００ｍｌのmidi cultureから300-500 ugものプラスミドが取れているのでベクター自体やculture条件、midiprep操作などは問題ないかと。。 実際、大腸菌を遠心すると十分量のペレットが見られますので。 空ベクターのプラスミドを持つ特定の大腸菌が問題なのかなあと感じています。他の日にストックしたlotも解凍してみようかとも思いますが、、highコピーのクローンを今midicultureしているのでそれを一度midiprepしてみる予定ではありますが、、原因究明が出来ないでいます。

(無題) 削除/引用 No.2278-2 - 2008/11/09 (日) 19:23:17 - ~ おかしいですね。 形質転換直後の状態で問題なかったのであれば、 プラスミドの状態で保存して、増やすときに入れなおした方がいいかもしれません。 1/10の収量の高いクローンを説明できるような説明が思いつきませんが。 ○ベクターの骨格は何でしょうか？ 実ははじめからlow copyで、以前に作ったときは収量を気にしていなかっただけということはありませんか？ ○Cultureはどのように行っていますか？ 容器に対する液量が多かったり、振倒がうまくいっていないために、あまり増殖していないということはありませんか？ ○プラスミドを入れなおしたらうまくいったりしませんか？ グリセロールストックの時に温度変化などのダメージを受けておかしくなっているのかもしれません。 （生えないことはあっても、収量が低くなるというのは見たことがありませんが） ○LB培地？が薄かったりしませんか？ 培地が薄いとあまりプラスミドは取れないと思います。

プラスミドが取れなくなりました。 削除/引用 No.2278-1 - 2008/11/09 (日) 18:11:46 - コンストラクト初心者+ いつも拝見させて頂き勉強させていただいております。 今回、形質転換後の大腸菌からのmidiprepでのプラスミド収量についてご教授いただけないでしょうか？ 過去のトピックでも類似したものがありましたが、私の問題を解決するような書き込みを見つけることが出来ませんでしたので、どうかお願いします。 以前、形質転換し終え、ちゃんとプラスミドを作ってくれる大腸菌を先日、融解してmidi culture後、キアゲンのmidiprepキットを用いて行いましたが、QFバッファーでelution後、イソプロ沈してもプラスミドペレットが見えない状態が続いております。 おかしいなあと思い、LA plateに撒き直しコロニーを１０個ほどピックアップしてminiprepを行ったところ、9/10コロニーがlow copyで1/10コロニーだけがしっかりプラスミドを作ってくれていました。 ちゃんと制限酵素で切ったりシークエンスして確かなものが回収できたと確信しています。 この１／１０の確率で出たコロニーをmidi cultureをやっているところで、結果はまだ出ておりませんが、このようなことは起こりえるのでしょうか？ つまり、もともとはクローンだったはずの大腸菌がグリセロールストックから解凍したらプラスミドのコピー数が減ってしまうことなど。。 クロラムフェニコールを加えるなど過去のトピックで勉強させていただきましたが、今回のような場合、１／１０のコロニーからまた大量培養して得ることが出来るのであれば、今後もこのようなことをして行っても構わないのでしょうか？ ラボの先輩の意見を伺うと、もともとはクローンだったはずなのにおかしいねとおっしゃられました。私は分子生物実験は素人ですので、今回のことが非常に珍しいという認識がなかなか持てないでいます。こういうものなのでしょうか？ 乱文雑筆で申し訳ありませんが、どうか皆様のご意見をお聞かせください、宜しくお願いします。

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