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(無題) 削除/引用 No.2256-6 - 2008/11/07 (金) 21:30:15 - からあげ あかね様、七子様、ありがとうございます。 あかね様の紹介して下さった論文では確かにヒストンがIPされてきているようでした。 著者のグループはSIGMAのきっとを使っていたのですが、そのキットのマニュアルを見たところ、特別な点は見当たりませんでしたが、どのような条件で行ったかについては、仰るとおり、聞いてみるのがよさそうですね。 七子さんの研究室で使われていたという溶解バッファーについてですが、上記のキットで標準として使われるバッファーにもTriton X-100 が含まれるようです。とりあえず、このバッファーを使ってヒストンがIPされるかについて調べてみようと思います。 また、励ましのお言葉についてもありがとうございました。 がんばってみます。

(無題) 削除/引用 No.2256-5 - 2008/11/07 (金) 20:19:07 - 七子 私が昔いた研究室では 1%TritonX-100 を含んだバッファーで溶解することでIP、western 両方で使用できるサンプルを調製していましたが、少なくとも western ではヒストンも検出できていたと思います(ソニケーションをしていたかどうかはわかりません)。 しかし、この条件で DNA Free なヒストンが調製できていたかについては疑問が残ります(というかたぶんできていない)。 あと、私個人としては、直接的相互作用であれ間接的相互作用であれ、きちんとしたコントロールがとれていれば構わないのではないかと思います。 確かに直接相互作用が見出せれば面白い結果となるかもしれませんが、間に何らかのタンパク質を介す必要があるかもしれませんし、ヒストンではなくヌクレオソームと相互作用することだってあるかもしれません。 修飾ヒストンとの相互作用は確かに in vitro で調べるのは難しいかもしれませんね。ただ、あかねさんが仰っておられるように、IPできている例もあるので、がんばってみてくださいね。

(無題) 削除/引用 No.2256-4 - 2008/11/06 (木) 18:56:26 - あかね 以下の論文参考になるかも知れません。 Dnmt3LでIPして、ヒストンが共沈しています。 http://www.nature.com/nature/journal/v448/n7154/full/nature05987.html さらっとみてもIPの詳しい条件が載っていなかったので、著者にコンタクトを取ってみると教えてくれると思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.2256-3 - 2008/11/06 (木) 17:45:57 - からあげ 通りすがりさん、ありがとうございます。 in vitro での実験系も考えたのですが、 実は私の場合、ヒストンと相手のタンパクが両方修飾されていることが結合の条件ではないかと予測されています(説明が不足してしまい、申し訳ありませんでした)。 大腸菌を使って発現させた場合、翻訳後修飾がされないという問題点があるため、in vivo で行う必要があると考えておりました。 何か良い方法があれば良いのですが…

(無題) 削除/引用 No.2256-2 - 2008/11/06 (木) 16:14:47 - 通りすがり ヒストンとの相互作用を見るのは論文数としても そんなに少なくはないはずですが ただIPで確認するのはほとんど無いというか あんまし意味がない実験です。 もしも無理にvivoでのendoでの相互作用をもし解析するならsonicationでなく nucleaseを用いてクロマチンを画分してから調べることもできますが おっしゃるようなsonicationでの解離や 多少残ったDNAを介しての相互作用でないか あるいは直接histoneに結合してるのでなく間接的なものでないか といった問題がどうしても疑問として出てきてしまいます。 一番確実なのは大腸菌などで作ったhistoneや あるいはtailなどとの相互作用が予測できるなら合成したペプチドなどを用いてvitroでの相互作用(GST-pull downなど)を解析することのほうがレフリーなどからはむしろ重要視されます。 あとたぶんrecombinantのhistoneってどっかで売ってた気もしますので それを使ってもいいかもしれません。 クロマチン関連の実験は結構vitroの実験をかなり厳密にやってないと vivoのdataも実際にはあんまし評価されなくなってしまう領域ですので、 その辺を押さえといたほうがいいですよ。

ヒストンのIP 削除/引用 No.2256-1 - 2008/11/06 (木) 13:59:22 - からあげ ヒストンタンパク質と、あるタンパク質の相互作用をIPで調べたいと考えています。 ところが、調べてみてもヒストンタンパク質をIPし、相互作用を調べたという実験例がなかなか見つかりません。 どなたかアドバイスを頂ければと思います。 ちなみに、私が調べたところでは、 細胞にNP-40を含むバッファーを使って核だけを取ってきた後、ソニケーション→IPといった手法がありました。 ただ、これだとソニケーションでタンパク-タンパクの相互作用が壊れてしまうのではないかという疑問があり、躊躇しています。 皆さんはどう思われますでしょうか？ また、ホルムアルデヒドでクロスリンクした後に抽出するという手法も過去のトピックで紹介されていましたが、 DNAを介した相互作用である可能性を(極力)除きたいため、クロスリンクしない方法を取りたいと考えております。

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