全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2254-13 - 2008/11/13 (木) 14:21:14 - masa >sin様 sin様もPBSの結晶化にあったんですね。 とりあえず、もう一度乾燥なしでmountingしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2254-12 - 2008/11/12 (水) 11:25:00 - sin >染色後はすぐ観察ということは、sin様はglass-bottom dishか何かを使用されているのですか？ 私は、セラミックス基板の上に接着させた細胞を観察しています。 基板の上に細胞を接着させ、基板をスライドグラスに載せて直接顕微鏡で観察しております。 特にマウントはしていません（褪色が早いのはそのせいかも知れません・・・）。 PBSの結晶化は、SEM観察のとき私も出くわしたことがあります。 凍結乾燥時のアルコール洗浄が不十分だったらしく、基板が食塩まみれになっていました・・・。 masa様の場合、観察前の乾燥過程を避けられればいいのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.2254-11 - 2008/11/12 (水) 10:38:07 - masa ＞りょう様 コメントありがとうございます。観察の準備では、あらかじめpoly-L-lysinコートはするときとしないときがありました。確かにアクチンを見るときはコートの条件を見極める必要がありますね・・・ PBSが結晶化していたのかどうかはわからないのですが、可能性を考えるとPBS以外残らなかったのでPBSかなぁと思いました。ただ、PBSの結晶化が不可解ということで、もう一度作り直してどうなるか見てみようと思います。 ＞うんこ様 リンク、ありがとうございます。ここでも結構洗浄は念入りにしていますね。

(無題) 削除/引用 No.2254-10 - 2008/11/10 (月) 12:24:01 - うんこ っhttp://square.umin.ac.jp/biochem2/contents/Manuals/manual73.html

(無題) 削除/引用 No.2254-9 - 2008/11/09 (日) 23:50:01 - りょう 洗浄によって細胞が剥がれてくるというのは問題ありですね。 ガラスをpoly-L-Lysineやコラーゲン、ラミニンなどでコートしておいて、細胞をまいた後、１，２日も培養すれば大抵の細胞は張り付きます（形態的に広がりやすいものは４ｈくらいでも可）。ストレスファイバーを観察するということからも、この辺りは適切な条件（何でコートするか）の検討が必要かもしれません。 CHOは皆さん良く扱われている細胞でしょうが、僕は使用したことがないので具体的なコメントができません。 PBS（リン酸由来）の結晶というのは不可解です。カルシウムなど混ぜていてそれが結晶化している？ マウント時に空気が入るのは、やり方次第です。僕は軽くキムワイプで水分をきって、乾かないうちに直ぐにマウントしています。

(無題) 削除/引用 No.2254-8 - 2008/11/09 (日) 22:01:29 - masa >Homer様 温度条件もあるのですね。PBSは室温のもの、PFAは普段４℃で保存しているものを直接冷えたままつかっていました。次にするときは教えていただいた条件でやってみます。 ＞りょう様 １．今まではsin様と似たprotocolで標本作成を行っていたのですが、洗浄の回数が多ければ多いほど標本完成までに細胞が洗い流されて減少したので、最低限の洗浄のみと最終的にはしました（固定化後の洗浄回数1回ということについては正直迷いました）。細胞が減るのは、もちろん、僕の技術的なものなのかもしれませんが、PBS等できる限りゆっくり入れて吸ってを行っても観察困難なまでに細胞数が減ったことが多かったので・・・ちなみに、使用している細胞はCHOとRH7777です。 りょう様が仰るというような可能性もあるようですので、今度は2回or3回に増やしてみます。 ２．phalloidin染色後の水での洗浄に関しては、これも今まではPBSで行っていたのですが、PBSで洗浄したものをそのまま標本とすると、この結晶が析出して測定が困難になっていたので、PBS成分の塩の析出ではないかということで、PBSを完全に水で洗い流すという考えで水にしました。実際、そうすることで析出物は現れなくなりました。 ３．洗浄後の乾燥についてですが、まず、mountingにはWAKOのソフトマウントを使っています。そして、塩の析出で困っていた頃、ならばと思い、一度、coverslipに水分が付着した状態でmountingを試したところ、ソフトマウントとうまく混じり合わなかったのか、水分の部分がまるで気泡のように標本に閉じ込められました。なので、乾燥させてからのほうがいいのではないかと思い乾燥を行っています。 ４．「適切」とはコートしているかどうかということでしょうか？ ＞sin様 protocolを教えていただいてありがとうございます。 染色後はすぐ観察ということは、sin様はglass-bottom dishか何かを使用されているのですか？ ＞おお様 りょう様にコメントした通りの理由からこの二つの作業を行っています。おお様はどう思われますか？

(無題) 削除/引用 No.2254-7 - 2008/11/08 (土) 16:20:01 - おお ６．milli-Qで2回洗浄 ７．37度で乾燥 ちゃんと見てませんでしたが、たしかにこの2つのステップは 一般的ではないですよね、、、、、

(無題) 削除/引用 No.2254-6 - 2008/11/08 (土) 15:37:09 - sin 私は蛍光顕微鏡でアクチン観察をしていますが、非常に鮮明に観察できていますので、一応、私のプロトコールを書いておきます。 私自身は完全な初心者ですが、何かの参考になれば。。。 １．Wellから培地を除去、PBS洗浄２回 ２．2.5％グルタルアルデヒドを加え、20分 ３．PBSで洗浄２回 ４．0.1％TritonXを加え、15分 ５．PBSで洗浄２回 ６．1％BSAを加え、30分 ７．PBSで洗浄２回 ８．Rhodamin-Phalloidinを加え、60分 ９．PBSで洗浄２回 以上、室温で操作。 染色が終了したら、すぐに観察しています。 観察まではPBS漬けにして、クーラーボックスに入れています。 乾燥は行わず、水分が邪魔な場合はキムワイプでちょんとつついて除去しています。

(無題) 削除/引用 No.2254-5 - 2008/11/08 (土) 14:42:24 - りょう 気になる点は以下の部分です。 ・固定後のwashが１回だけで良いのか？ 固定液をしっかり除いておかないとブロック用に使用されているBSAが細胞内蛋白(アクチンも含めて）に非特異に架橋されて像がfazzyになる？(根拠のない想像の域ですが）。 ・phalloidin染色後のwashは水で良いのか？PBSで何故行わない？ ・乾燥って一般的に行いますか？私は乾燥させずにmountして観察します。 （In situハイブリダイゼーションの時は乾燥しましたが）。 ・細胞のガラスへの接着は適切なのか？

(無題) 削除/引用 No.2254-4 - 2008/11/08 (土) 08:54:36 - Homers 固定の条件でだいぶ違ってきます。 いちばん綺麗な染色像が撮れたのは、 標本を３７度に温めた4%PFAもしくは 3.7%ホルマリンで１５分素早く固定することでした。 固定前の洗浄用PBSも同様に温めておきます。 その後の操作は特に特別な条件はありません。 以前、低温（on ice）で１時間固定する条件の 抗体と二重染色を試みた時に、いつも染まっている phalloidinが全く染まらないので、温度条件を 振ってみたところ、この性質に気づきました。

(無題) 削除/引用 No.2254-3 - 2008/11/08 (土) 01:47:18 - masa おお様 丁寧なご返信ありがとうございます。 アクチンに関する以前のトピがあったことは知りませんでした・・・ｚ軸スキャンも回数はこなしていませんが、何度か試したことはあります。そのときはあまり変化がなかったのですが、過去にそれによる改善の事例があったということで、もう一度検証してみます。 蛍光顕微鏡ではあまりきれいに見えるというイメージがなかったので、見ていませんでした。そちらも一度見てみます。

(無題) 削除/引用 No.2254-2 - 2008/11/06 (木) 14:40:01 - おお もしかしたら読まれたかもしれませんが、同じようにアクチンのファイバーが きれいにきょう焦点で見えないというとピがありました。 とピ主さんは固定方法など疑っていたようですが、 もしかしたら見ている平面では、その平面をアクチンファイバーが横切って いてファイバー全体がとらえ切れてないのではとおもい、z軸でスキャンして その画像を重ねて上から見たようなイメージを作ればどうかと提案しました (この方法はよく脳組織の切片で軸索などをフォローするときにつかわれます)。 結果的にそれで改善したようです。今回もそうかというと分からないのですが 一度試してみる価値はあるかなと思った次第です。 普通の蛍光顕微鏡ではどうみえますか?それだと１平面ということではないので ぼけて見えるかもしれませんが、ファイバーは追えるかもしれません。

共焦点の画像について 削除/引用 No.2254-1 - 2008/11/06 (木) 13:35:14 - masa こんにちは。 Bio-technical foramはよく参考にさせていただいています。 現在、rhodamine-phalloidinを使って、リガンド刺激による受容体を介した細胞のアクチン変化を見ているのですが、なかなか論文で見るような鮮明な図を得ることができずに困っています。それっぽいものが見れないことはないのですが、繊維状のものとはとても言えない状況です。なんかボケているというかノイズのようなものがかかっているというか、文章で表現するのが難しいのですが、とにかく鮮明に見ることができないのです（これらについてはphotoshopやGIMPで補正をかければ済むのかもしれませんが）。もちろん、共焦点の性能の違い等は少なからずあるとは思うのですが、それだけでは僕としては納得したくないということで皆様にお聞きしたいと思いました。共焦点顕微鏡はオリンパスのFV-1000です。オリンパスの方にもその旨お伝えして、何かうまく画像を取る方法はないのかとお聞きしたところ、「光軸のずれなどなく、観察の際の顕微鏡の使い方に関しても基本的には問題ないので、あるとすれば標本の作り方かもしれません」とのことです。 そこで、もし標本作りに詳しい方がいれば、何かアドバイスをいただけると嬉しいです。また、FV-1000でアクチンを見た方がいらっしゃれば、顕微鏡を使用するコツなどをご教授いただけると助かります。 作業は次のように行っています。 １．12wellにcoverslipを入れて細胞を接着させる。 ２．PBS(-)で１回洗浄 ３．paraformaldehydeで固定化　20分放置 ４．PBS(-)で1回洗浄 ５．0.1% Triton X-100/1% BSA/PBS(-)＋rhodamine-phalloidin (3.5nM)を加えて　1hr放置 ６．milli-Qで2回洗浄 ７．37度で乾燥 ８．mounting 観察。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---