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(無題) 削除/引用 No.2246-4 - 2008/11/07 (金) 16:55:22 - xyz 共沈する蛋白質を同定すれば高度に精製するための情報が何か得られるかもと思いました。これは多くの蛋白質は複合体の一部として機能している場合があるので、無理して見たいものだけを選んでとってきて機能解析する場合せっかくインビボで得た重要な知見を見失う恐れもあるからそう思います。あと修飾部位は既知、あるいは予測可能でしょうか。もしそうならその部位を別のアミノ酸に置換したflag蛋白質を発現させたとき、共沈するといういくつかの蛋白質はどのようになるでしょうか。単離して機能解析へ、と急がなくてもいまの時点でも機能を調べる上でいろいろ面白いことが出来るようにおもいますが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2246-3 - 2008/11/06 (木) 12:48:33 - お〜いお茶 おおさん、 貴重なご意見ありがとうございました。 やはりゲルろ過でサイズを分けていくほうがよい見たいですね。 急がば回れでやってみようとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2246-2 - 2008/11/06 (木) 04:08:59 - おお FLAG IPだけではちょっと難しいと思います。方法論はいろいろあり、 カバーできないですが、、、ほかの生化学的な精製の手法と併用させる 方がいいかと思います。 たとえはサイトゾルのものであれば、界面活性剤ぬきで細胞や組織を ホモジナイズし、硫安沈殿ごゲル濾過でバッファー置換とサイズ分画 をしてIPするとか。 その他プレパラティブな(SDS)PAGEや等電点電気えいどうとか、 最後までネイティブな条件でコンプレックスがIPされている可能性 があるなら2Dで目的のスポット切出しなど。 基本的にCBBでシングル(あるいはウエスタンで検出できるバンドのみ)まで 絞り込む方があとの解釈が楽です。

哺乳類細胞からのタンパク精製 削除/引用 No.2246-1 - 2008/11/05 (水) 21:48:23 - お〜いお茶 はじめまして。 　私は培養細胞に強制発現させたFLAGタグ付のタンパク質を精製する必要があり、その方法に関して教えていただきたく投稿しました。 　タンパク質に対する修飾を内因性のものに近づけるためにこのような方法をとることにしたのですが、ひとつ問題があります。FLAG-agaroseでIPをすると、そのタンパクと共沈するタンパクが複数あります。普段だったらうれしい結果なのですが、今回は目的のタンパクのみを回収したいので、それらをはずす必要があります。しかし、アガロースに結合した状態でその後の機能解析の実験を行いたいので、還元剤などの使用は困難とかんがえております。 最終的にFLAG-アガロースに結合さえ保てていれば、その後バッファーを適当なものへ交換して次のステップへすすもうかと考えておりますが、このような場合、塩濃度やなどで対処が可能なものでしょうか？アドバイスよろしくおねがいします。

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