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(無題) 削除/引用 No.2240-4 - 2008/11/05 (水) 13:20:53 - AP 相補鎖を含む鋳型は取り除けませんが、asymmetric PCRもあります。 PCRなどで調製した二本鎖の鋳型に対して、片側のプライマー（この場合、標識済み）のみを加えて、20サイクル以上PCRをかけます。de novoのss DNAが鋳型より一桁多くできますので、多くの目的で鋳型の残留は問題になりません。 ISHなどでRNA probeのかわりにstrand specific probeとして使います。in vitro transcriptionより鋳型を選ばずコンスタントに標識できますし、strand specificityなどのperformanceも良いです（in vitro transcriptionだと反対鎖のprobeができて、sense probeはずなのに、NorthernでチェックするとターゲットRNAが検出されることがしばしばある）。 どうしても、鋳型をきれいに取り除きたいなら、ビオチン付加プライマーでPCRしたDNAを鋳型としてasymmetric PCRで標識後、アビジンビーズで鋳型を取り除くという応用も出来そうです。 銅羅さんの >NaOHを加え、ビーズにくっついた目的じゃないほうの鎖を除いて目的のssDNAを得る で、標識法によってはNaOHではずれるものもあるので、使用する標識に耐性があるかどうか確認しておく必要があるでしょう。熱変性で代替できるとは思いますが。

Re: single strand DNA の合成 削除/引用 No.2240-2 - 2008/11/05 (水) 10:17:01 - 銅羅 目的じゃないほうの鎖のプライマーをビオチン修飾し、普通にPCR ダイナビーズなどのストレプトアビジンビーズとインキュベートし遠心などでdsDNAを精製 NaOHを加え、ビーズにくっついた目的じゃないほうの鎖を除いて目的のssDNAを得る という手順で、とったことがあります。 ダイナビーズ（確かインビトロジェン）のホームページや他にもどこかの研究室のホームページ（たしかシークエンスのテンプレートを作製する際のssDNAの調整の仕方的なページ）なんかに詳しいやり方が載っていました。

single strand DNA の合成 削除/引用 No.2240-1 - 2008/11/05 (水) 09:55:24 - あかね single strand DNA(200 b程度）の合成を行おうと思っています。 用途としてはFISH等のprobeに使います。 probeには特殊な修飾を入れたいので、特殊修飾をしたオリゴを伸長させることでssDNAを合成したいと考えています。ということでM13などのファージの系ではなくin vitroでポリメラーゼを使ったssDNA合成を検討していますが、どの方法が効率よくssDNAを合成できるか判断しかねています。 そこでssDNAを合成したことがある方、方法などをご教授ください。 また、ssDNAを合成したあとに目的のstrandのみを回収したい（余計な逆strand, templateの除去）のですが良い方法があれば一緒にお願いします。

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