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(無題) 削除/引用 No.2238-9 - 2008/11/05 (水) 17:00:16 - ryo EcoRIさん > ２回も済みにされているのに、またレスを付けて申し訳ないです。 いえいえ。 こういうおまけのアドバイスはとっても有効ですから、気付いたことがあったら、是非教えてください。 これらの知恵を後輩に伝授すれば、今後スムーズに操作できるでしょうし。 > TCA沈殿の沈殿産物をわざわざ生理的な塩濃度のバッファーに溶かす必要はないのです。 > というか、まず溶けませんから。 確かに。 以前、濃縮の意も兼ねて、今回と違うタンパク質でTCA沈殿を試したのですが、最終沈殿物が溶けませんでしたから。 今回の場合、濃縮もしたいですが、 結局はSDS-PAGEにアプライして、うまく泳動できるようにするのが目的ですので、 変性効果があるSDSが入っているSDS-PAGEサンプルバッファーを添加すれば、溶け残ることなくできそうですね。 使わない分は凍らせないで、冷蔵庫など４℃で保存しておけば、ある程度の日数は持ちそうですし。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2238-8 - 2008/11/05 (水) 16:39:57 - EcoRI ２回も済みにされているのに、またレスを付けて申し訳ないです。 TCA沈殿の沈殿産物をわざわざ生理的な塩濃度のバッファーに溶かす必要はないのです。 というか、まず溶けませんから。 そのまま、SDS-PAGEのサンプルバッファーに溶解してしまえばいいのです。 サンプルバッファーにはSDSが入っているはずですから、溶けるはずです。 変性をオーバーナイトでされている、とのことですが、 TCA沈殿ならTCAで強力に変性させてしまうので、その後の還元やSDS化も早く済みます。

(無題) 削除/引用 No.2238-7 - 2008/11/05 (水) 16:18:19 - ryo EcoRIさん 続けてのアドバイス、ありがとうございます。 透析と言ったら思いつく透析ではなく、 それよりもミニスケールでできる透析ですね。 知恵次第でどうにかなるというのはこのことだなと思いました。 これなら、遠心限外ろ過を避けたくて、液量が少ないからどうやってバッファー交換しようかというワガママが満たされそうです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2238-6 - 2008/11/05 (水) 16:02:33 - EcoRI 透析という手もあります エッペンチューブの蓋を切り取って、透析膜をセットし、 チューブの胴体につけて、輪ゴムなどできっちり固定します。 で、フローターにセットして、透析外液が入ったビーカーに浮かべておけば、 透析できます。 基本的に、透析する上での注意事項を守れば、脱塩できるはずです。

(無題) 削除/引用 No.2238-5 - 2008/11/05 (水) 16:02:26 - ryo EcoRIさん TCA沈殿も考慮しましたが、 最終沈殿物がバッファーにきちんと溶けるかどうかを判断して、 変性力がTCAより低いアセトンならうまくいくかもしれないということで、 アセトン沈殿に着目しました。 サンプルは確かに希少で、あまり使いたくないのですが、良い結果が出る可能性を選んで、 アセトン沈殿産物のSDS-PAGE結果があまり良くなかったら、 次はTCA沈殿に供してみようと思います。 プロトコルのサイト、添付して下さってありがとうございました。 非常に助かります。

(無題) 削除/引用 No.2238-4 - 2008/11/05 (水) 15:48:55 - ryo APさん > バッファーだけで予備実験してみては。 確かに、そうですね。 サンプルしか見えてませんでした･･･ そういう確認なら、簡単にできますし。 今晩から仕掛けてみようかな、と思います。 > エッペンチューブサイズの遠心限外ろ過でバッファー交換 確かに、その方法でバッファー交換という手がありました。 マイクロコンですね･･･ ですが、最近、複数回、アミコンウルトラによる遠心限外ろ過で痛い目にあってますので、 あまりこの手法は使いたくないのです。 僕の今扱っているタンパク質と相性が悪かったのかどうかはわかりませんが･･･ 実際、先日サンプルをアセトン沈殿に仕掛けてみたのですが、 ふんわりした白い沈殿ができました。 これをアセトンで洗浄して、バッファーに溶解。 僕の扱っているタンパク質は変性されにくいらしく、SDS-PAGEのサンプル処理は一晩。 明日の泳動、どうなるか、楽しみです。 あと、バッファーだけの検討も並行してやるので、そっちの結果もどうなるか楽しみです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2238-3 - 2008/11/05 (水) 14:49:17 - EcoRI APさんの仰るように、アセトン沈殿では条件検討が必要でしょう それが面倒でand/orサンプルが希少なら、 TCA沈殿をお薦めします。 TCA沈殿で落ちて来ないようであれば、メタノール／クロロホルム沈殿でしょうか プロトコルは以下のサイトの"Normal TCA"をご参照ください。 http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/ProteinPrecipitation.html

(無題) 削除/引用 No.2238-2 - 2008/11/05 (水) 14:12:58 - AP バッファーだけで予備実験してみては。アセトンを加えて塩が析出してこなければいいわけで。Trition Xはどうなるかわかりませんが、最悪、層分離するにしても、沈殿するということはないように思います。 タンパク質のアセトン沈殿では、4から10倍体積のアセトンを加えます。 少なくともNaClは100%アセトンには不溶ですが、アセトンの終濃度を低く抑えれば塩を落とさないでサンプルタンパク質が回収できる条件があるかもしれません。 >透析などにより脱塩しようと考えたのですが、手元にあるサンプル液量が100μl エッペンチューブサイズの遠心限外ろ過でバッファー交換するにはちょうど良い量ではあります。

アセトン沈殿で脱塩？ 削除/引用 No.2238-1 - 2008/11/05 (水) 01:17:52 - ryo 高濃度のNaCl(過去の実験者のノートからすると3M NaCl)と界面活性剤のTriton X-100(同じノートから察すると0.5%)が入ったサンプルがあります。 これを、SDS-PAGEにアプライしたのですが、案の定、サンプル中の塩濃度またはTriton X-100の存在が原因で、泳動幅がブロードになったりと障害が起こってしまいました。 透析などにより脱塩しようと考えたのですが、手元にあるサンプル液量が100μlと少ないので、ロスが大きいでしょうし、敬遠しています。 そこで思いついたのが、「アセトン沈殿」です。 これにより、最低でも界面活性剤であるTriton X-100は除去できるでしょう。 あと、ついでにNaClも除去できれば良いのですが･･･ シンプルな質問で申し訳ないのですが、 アセトン沈殿により脱塩はされるのでしょうか？ 可溶性不純物を除けるとか書かれている資料がありますが、どうも曖昧なので不安です･･･ どうでしょうか?? ご回答、よろしくお願いします。

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