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(無題) 削除/引用 No.2231-4 - 2008/11/04 (火) 15:54:50 - おお そうそう、書こうと思ってわすれていた、、、 エンドの発現は気にしなくてよいのでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2231-3 - 2008/11/04 (火) 15:34:54 - おお 私なら、片方を誘導型にするかもしれません。 タンパクの(強制)発現はいろんなことが絡んできます。 プロモーターの強さだけでなくmRNAの安定性、翻訳の効率(イニシエーション、コドンユーセイジ)たんぱく質の安定性や、そのレギュレーションなど、、、、 したがってプロモーターを工夫してmRNA量を両者で同じぐらいに合わせたとしても、実際タンパク量はどうなるか分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2231-2 - 2008/11/04 (火) 13:49:46 - ~ 2つの異なるタンパク質の量を定量する系はもう立ち上がっているのでしょうか？ それだけでも一実験必要になるかと思います。 pBUDCE4.1はCMVとEF-1aのプロモーターが入っているものですよね。 これで発現量があえば、比較的操作は楽になるでしょうけれども、 発現量が違った場合、調整のしようがないかと思います。 (プロモーターにうまく変異を入れて発現量を調節するというのは非常に難しいでしょう) そのため私なら、2つの別の発現ベクターに入れて、両者の量比で発現量をコントロールしようとします。 始めに3段階くらいの量比で振って(3:1, 1:1, 1:3など)、それぞれ20クローンくらい拾えば、 大体の発現量の傾向が分かると思います。 そこで取れればいいですし、取れなければその傾向を元に入れるベクター量を調節します。 1つの発現ベクターを入れてクローンを拾ったときに、クローン間の発現量は数倍以上というのは珍しくないので、 大体の発現ベクターの比率が決まったら、後はひたすらクローンを拾うだけでしょう。 しばらく継代していたら、片方が発現しなくなった。というと困りますので、 早めに大量にストックしておいた方がいいかと思います。

2つタンパク質の共発現（培養細胞） 削除/引用 No.2231-1 - 2008/11/04 (火) 12:56:08 - トランジエント ヘテロダイマーの膜タンパク質にGFPを付けてトランジエントに培養細胞に発現させようと思っています。2つのサブユニットを同時にできれば同じくらいの量で発現させたいのですが、 一つのプラスミドに二つの発現カセットが入っているもの。（InvitrogenのpBUDCE4.1など) 二つのタンパクの発現ベクターを別々に作って、co-transfection。 IRESも考えましたが、IRESより後ろは発現量がかなり下がる。 と聞いてますが、この場合どういう方法がいいと思いますか？アドバイスをもらえたら助かります。

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