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(無題) 削除/引用 No.2229-4 - 2008/11/04 (火) 03:05:36 - おお 例えば薄めてタンパク同士のアグリゲーションを防ぎながら リフォールディングするなら、その後濃縮したいでしょうし、 あとから精製というのは、そういう意味ではステップを減らすことが できるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2229-3 - 2008/11/03 (月) 22:36:23 - AP 全部ではないかもしれませんが、生理条件でnativeなタンパク質は可溶性であると考えて良いです。細胞内は親水的な環境なので、不溶性のタンパク質が存在するとすれば、それは生理的に不活性ということになります。 細胞内では実際にはシャペロニンなどが正常なfoldingを助けてはいますが、生理条件、あるいはそれに近い状態で時間をかければ、ペプチドは自発的に、熱力学的に一番安定なfoldingに落ち着き、それが生理的なfoldingと一致すると言われています。 大腸菌で大量発現させたタンパク質がinclusion bodyとなり不溶化するのは、短時間で大量に発現されたタンパク質の「正しい」foldingが追いつかないため、めちゃくちゃに折りたたまれること、また大腸菌にとっては異物なので排除に向かうためと言えます。 不溶化したタンパク質を変性後、refoldingする目的は生理状態と同じfoldingをさせるためであって、うまくいけば可溶性になると期待しやるのが普通です。 したがって、 >refolding後はタンパクが再び不溶化してしまい、 そうなったらrefoldingに失敗したと考えますね。カラム精製してからrefoldingを試みて不溶化した場合も同じです。 わたしなら、変成、カラム精製したあとrefoldingを考えますが、refoldingしてからカラム精製という例があっても奇異には思いません。どちらでも良いか、扱う材料によりケースバイケースなんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2229-2 - 2008/11/03 (月) 22:20:44 - A >初心者的な質問ですが、refolding後はタンパクが再び不溶化してしまい、ニッケルカラムでの精製ができなくなる気がするのですが、Refolding後にニッケルカラムで精製することは可能なものでしょうか？ もちろん可能です。 但し精製ビギナーさんが危惧されている様にRefolding後のタンパク質はfoldingが完全にされていないことが多くカラムに非特異的についてしまったりカラム上で他のタンパク質分子と会合して出てこなくなったりすることが多いようです。私が１−２年前に精製したRefoldingされたタンパク質の場合、Refolding後にゲルろ過カラムにかけてたところ回収できたのはだいたい５％ぐらいで毎回つまったタンパク質を除くためにカラムをきちんと洗いなおす必要がありました。 私ではないのですが学会であった北米の某教授の研究室ではRefolding後に精製をしているといっていました。この場合、混在している他のタンパク質の存在が目的タンパク質分子同士の会合を防ぎながらRefoldingできるメリットがあるといっていました。彼らは透析法でRefoldingしていましたが透析毎のバッファーの量が２０−３０L、つまり一回のRefoldingに６０−９０Lのバッファーを使っていましたから何処まで参考になるのかわかりませんが。

His-tagタンパクのrefolding 削除/引用 No.2229-1 - 2008/11/03 (月) 21:34:03 - 精製ビギナー 現在His-tagタンパクの精製を行っています。 BL21で発現させた後、タンパクが封入体中に存在するためグアニジンで溶解しています。 その後なのですが、教科書的には変性条件下でHis-tagタンパクをニッケルカラムから溶出させ、その後Refoldingさせると書いてあります。 　しかし、今回の目的タンパクの精製を行っている過去の文献では、グアニジンで変性後、refoldingをさせて、その後ニッケルカラムで精製と書いてありました。 　初心者的な質問ですが、refolding後はタンパクが再び不溶化してしまい、ニッケルカラムでの精製ができなくなる気がするのですが、Refolding後にニッケルカラムで精製することは可能なものでしょうか？

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