お世話になります。
質問させてください。
現在、刺激に依存して分泌される酵素（LDH:乳酸脱水素酵素）の活性を評価しています。
positive controlとしては1 % triton X-100で壊したものを用いています。assay自体はきれいに動いています。
ここで、疑問なのですが、細胞をあらかじめ刺激して、一定時間後、上清Aを回収し、基質溶液Bと混合するのですが、上清Aを回収する前にピペッティングで混ぜた方がいのではないかという疑問を持ちました。
もちろん細胞がその操作で死なないような程度で、ですが。
というのも、positive controlとしておいたwellはピペッティングする前と後では値がずいぶん違っており、ピペッティングした後、十分細胞が可溶化されたのか、posiconらしい値が出ます。
つまり、ピペッティングする前ではそのwellの中で濃度勾配ができているんだと思います。
もちろん、それはposicon wellだけでなく、他のwellでも起こっていると思います。
こういう場合は混ぜた方がいいのかなあという印象を持ちます。
もちろんピペッティングする前と後で「無刺激」wellの値は変わらない程度におさめなければならないのが前提ですが。
みなさんはどうされますか？
ピペッティングした後で、更に浮遊した細胞を一度plateごと遠心するのも手かなとも思っています。
みなさんは培養上清をELISAなどに用いる際にどのようにしておりますでしょうか？
教えていただけないでしょうか、よろしくお願いいたします。 |
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