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(無題) 削除/引用 No.2225-12 - 2008/11/03 (月) 21:58:31 - D 皆様のコメント通りだと思います NM_XXXXXX のようなACCESSION No.の配列は あくまでも一例に過ぎないことを理解するべきだと思います 初心者だと意外かもしれませんが結構違うことが多いです それに変異はあっても削れたりすることはそうありません GやCが連続してるとかだと別ですが変異より飛ぶのは起こりにくい気がします KOD plusは変異が入りにくい酵素です これを使っているならならそうそう変異は入らないでしょう もっと可能性から合理的な判断を下せるよう マニュアル人間から脱却するのが一番の課題だと思います

(無題) 削除/引用 No.2225-11 - 2008/11/03 (月) 19:16:21 - シークエンス みなさま いろいろと本当に有難うございました。 明日以降、ラボに行った後いろいろ試してみて、何か進展があり次第報告致します。

(無題) 削除/引用 No.2225-10 - 2008/11/03 (月) 08:19:49 - ~ >�B１と２をそれぞれゲルに流して精製しライゲーションしたあとベクターに入れる >という意味でしょうか？ そうです。 >削れている部分を正しい配列にしたプライマーを作り、削れているプラスミドをテンプレートにして1周まわすPCRをする、ということでしょうか？ そうです。他にエラーが入らないようにするために、 変異を含む短い部分を一度サブクローニングした方がいいでしょう。 >別の材料をテンプレートとしたほうが速くて王道なのでしょうか・・・？ あなたが、”データベース上の配列”を使いたいのであれば、 その配列を得た材料と同じ材料を使った方が、 後で論文に書くときに「別の材料だけれども、こことここに変異を入れてBと同じ配列にした」などという説明をしなくてすみます。 早いかどうかは、その材料が手に入るかどうか次第でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2225-9 - 2008/11/02 (日) 19:30:24 - AP 考えられることは、皆さんのコメントにつきるのですが、十分理解されていないのかもしれません。 >塩基がちょこちょこ削れたりしてエラーが入ります。 まず、何をもってエラーと判断したかですが、databaseに登録された配列と比べてみてというなら、系統間、系統内の多型で配列が同じではないということはごく普通にあるのですが、それではないのですか。databaseに登録された配列が不正確という可能性も否定できません。それとも、自前でダイレクトシークエンスをした配列と、クローニングした配列が一致していないということでしょうか。 PCR産物を（クローニングせずに）ダイレクトシークエンスすると、鋳型の配列を確認できます（mutationが分散するので、それぞれの塩基位置で多数派となる、mutationが入っていない配列が読める）。 >読んだ配列が本当は正しい・・・そう思いたいのですが、複数のクローンで全く同じ場所（1200bpあたりと2400bpあたりに）で、２箇所けずれているので、多分本当に削れているのだと思うのです。 調べた複数のクローンが同じ配列だったなら、PCRの鋳型がその配列だったという可能性をまず考えますが。それらの欠失でフレームシフトが起こったりして遺伝子の意味が失われるというなら考えものですが。

(無題) 削除/引用 No.2225-8 - 2008/11/02 (日) 18:01:38 - おお 結局何がしたいのか分からないので、なんともコメントできないのですが、、 テンプレートが参考にしている配列とオリジンが違うため配列が違うなら、 選択肢は2つです。"テンプレートの配列で実験をする"と"参考にしている配列の ソースと同じものを得てやり直す(あるいは得たれた物をテンプレートにミューテション を入れて、参考にしているソースの配列に変換する)"です。 いままで、そのテンプレートの配列をもった実験系で実験してきたのならなおさら、 テンプレートの配列でやるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2225-7 - 2008/11/02 (日) 17:08:01 - シークエンス -さま コメント有難うございます。 早速自分がクローニングした遺伝子の塩基配列をblastで検索したいのですが、今家にいるので、シークエンスを読んでGENETIXを用いて手作業でコンティグしたデータが手元にありません・・・。 ラボに行ったら早速やってみようと思います。 ああ、、欠損が見られる塩基配列があるかどうか気になります・・・。。 アドバイス有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.2225-6 - 2008/11/02 (日) 16:18:12 - - 塩基配列は個体によって若干違う事がよくあります。 たとえば、あるマウスの遺伝子において、 B6とBALBの塩基配列を比較すると、 ホモロジーが98％ということがよくあります。 なので、データベース上に公開されている１つの配列と比較して この配列は違うから、PCRの段階でミューテーションが入った ということは言えません。 一度、ご自身でクローニングした遺伝子の塩基配列をblastで 検索してみてください。 欠損が見られる塩基配列があるかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.2225-5 - 2008/11/02 (日) 16:05:06 - シークエンス ~さま 再度のアドバイス有難うございます。非常に嬉しく、心強く感じます。 >[Re:4] ~さんは書きました : > まず大事なのは、あなたが参考にしている配列情報が正しいかどうかの確認だと思います。 リソースセンターで公開している配列なので、参考にしている配列情報は正しいのだと思います。。 > >複数のクローンで全く同じ場所で、２箇所けずれているので > 1つもそこが削れていないクローンは無いのですか？ > だとしたら、今使っている材料だと、その部分はもともと無い配列と考える方が合理的だと思いますけど。 ああ、、、、そうなってしまいますか・・・。。 ってことは、、そもそもインサートを作ったテンプレートがダメってことですよね。。。 つらい。。。 > >KOD-plus-を使っているのですが > 個人的には、LA-taqが好きです。ただ、KOD-plusならば十分だと思います。 そうなのですか。安心しました。助言有難う有難うございます。 ラボでLA-Taqというのは見かけたことはなかったと思うので、新しく買ってもらうのは気がひけるので、KOD-plus-で頑張ろうと思います。 > >削れている部分をaとbとした場合 > 例えば > 1:---EcoRI--a--BamHI------HindIII- > 2:---EcoRI-----BamHI---b--HindIII- > という場合、1のBamHI-----HindIIIと２のEcoRI-----BamHIをつなげれば、 > ---EcoRI-----BamHI-----HindIIIになります。 細かく説明してくださって有難うございます。 見知らぬ方に親切にしていただいた嬉しさのあまり感動しました！ つまり、この図だと、 �@１をBamH�TとHind�Vで切る �A２をEcoR�TとBamH�Tで切る �B１と２をそれぞれゲルに流して精製しライゲーションしたあとベクターに入れる という意味でしょうか？ > Site-directed mutagenesis で求める配列に変えることは出来るでしょうけれども、その前に配列情報が正しいのかを確認する必要があるでしょう。 あまり聞いてばかりだと申し訳ないのでSite-directed mutagenesisというのを調べてみました。（調べていて書き込みが遅くなりました、、すみません。。） 削れている部分を正しい配列にしたプライマーを作り、削れているプラスミドをテンプレートにして1周まわすPCRをする、ということでしょうか？ > まずは、別の材料でクローニングしてみてはいかがでしょうか。 教えていただいた「切り貼りする方法」や「Site-directed mutagenesis」 よりも、別の材料をテンプレートとしたほうが速くて王道なのでしょうか・・・？ 長文になり申し訳ございません。 ~さん、いろいろ有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.2225-4 - 2008/11/02 (日) 14:33:14 - ~ まず大事なのは、あなたが参考にしている配列情報が正しいかどうかの確認だと思います。 >複数のクローンで全く同じ場所で、２箇所けずれているので 1つもそこが削れていないクローンは無いのですか？ だとしたら、今使っている材料だと、その部分はもともと無い配列と考える方が合理的だと思いますけど。 >KOD-plus-を使っているのですが 個人的には、LA-taqが好きです。ただ、KOD-plusならば十分だと思います。 >削れている部分をaとbとした場合 例えば 1:---EcoRI--a--BamHI------HindIII- 2:---EcoRI-----BamHI---b--HindIII- という場合、1のBamHI-----HindIIIと２のEcoRI-----BamHIをつなげれば、 ---EcoRI-----BamHI-----HindIIIになります。 Site-directed mutagenesis で求める配列に変えることは出来るでしょうけれども、その前に配列情報が正しいのかを確認する必要があるでしょう。 まずは、別の材料でクローニングしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2225-3 - 2008/11/02 (日) 14:16:12 - シークエンス ~さま コメント有難うございます。 >[Re:2] ~さんは書きました : > １．本当は読んだ配列の方が正しいのではないかと考える 読んだ配列が本当は正しい・・・そう思いたいのですが、複数のクローンで全く同じ場所（1200bpあたりと2400bpあたりに）で、２箇所けずれているので、多分本当に削れているのだと思うのです。 > 複数のクローンで配列が違っているのであれば、 > ２．もっといい酵素で増やす KOD-plus-を使っているのですが、、もっと良い酵素があれば教えていただけると嬉しいです。 > ３.あっている部分を切り張りする 1.のところで書きましたように、複数のクローンで同じところが削れているので、合っている部分を切り貼り、ということはできないのですが。。。 ちなみに、もし削れている部分が違った場合「あっている部分で切り貼り」というのは、たとえば、削れている部分をaとbとした場合、どういうふうに行うのでしょうか？ あまりクローニングというものをしたことがないので、聞いてばかりですみません。。 もしよければ、教えていただけると有り難いです。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2225-2 - 2008/11/02 (日) 10:59:33 - ~ １．本当は読んだ配列の方が正しいのではないかと考える 複数のクローンで配列が違っているのであれば、 ２．もっといい酵素で増やす ３.あっている部分を切り張りする

クローニングでエラーが入ってしまいます。 削除/引用 No.2225-1 - 2008/11/02 (日) 06:16:36 - シークエンス クローニングをしているのですが、全長シークエンスで確認すると、インサートの配列が長いためか、塩基がちょこちょこ削れたりしてエラーが入ります。削れたものを正しい配列にするにはどうしたらいいのでしょうか・・・？ もしよろしければ教えていただけると有り難いです。宜しくお願い致します。

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