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(無題) 削除/引用 No.2224-10 - 2008/11/05 (水) 13:00:57 - - まっくろんさんの仰る通り、血清の希釈倍率を 上げてみるというのが良いんじゃないでしょうか。 マウスのOVA特異的IgEを検出するELISAキットを見ると 希釈倍率の目安が10〜50倍と書いてありますね。 どのくらいの濃度か全くわからないサンプルを使うときに 希釈倍率を振るのは必須事項だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2224-9 - 2008/11/05 (水) 11:53:07 - まっくろん 　なるほどやっかいですね。 　IgEの検出値は低いかということですが、低いです。というより、IgEそのものが少ないです。IgGと同じ検出系（血清量や抗体量）で行っていると検出できないこともあります。その際は、血清量を増やす、プレートにコートするタンパク量を増やすなどを行って検出感度内に持ってくる必要があるように思います。 　まずは血清濃度を振って、検討するのが妥当だと思います。血清に余裕があるのなら2-3サンプルでよいので、1/10もやってみるといいですね。Total IgEが上昇しているということから、IgEが上昇していないというのは、正直考えにくいと思うのですが・・・。

なぞです（涙） 削除/引用 No.2224-8 - 2008/11/04 (火) 22:48:52 - クリパン �@アプライするIgE量…1/1000希釈です。 �A二次抗体について…二次抗体anti-rat IgEを用いています。そして、二次抗体のみを固定して発色試薬と反応するのを確認しています。また、総IgE ELISA kitに含まれている二次抗体を用いても検討してみましたが、発色しませんでした。 �BIgEが上昇していない…どうなんでしょう。。。！？ 特異的IgEの測定は一般的に検出値は低いのでしょうか？ とりあえず、血清量を1/100で検討してみます。 細かいご指摘ありがとうございました。 とても、参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.2224-7 - 2008/11/04 (火) 16:05:33 - まっくろん 　specific IgGは測れるんのですね。それを伺った上で私が思いつくのは．．． �@アプライするIgE量（血清量）が少ない �A二次抗体が働いていない �BIgEが上昇していない あたりでしょうか・・・。�Bはちょっと考えにくいと思うんですが・・・。 �@ですが、どのくらいの血清量を添加してますか？私が測る際は（マウスですが）、感作している場合、1/100になるようにしています。あと、IgE量が少ない場合発色が弱いですが、多すぎる場合にも発色が弱まると言う話を聞いたことがあります。 ただ全く発色しないとのことなので、�Aが有力かも。発色液中にごく微量の二次抗体入れたらきちんと発色しますか？これが発色しない場合はもちろん駄目です。あと抗体が、anti-rat IgEじゃなくて、rat anti-IgEなんてことはないですよね（それでも検出できそうですが）。 　また、総IgE ELISA kitがもし残っていたら、スタンダード1-2サンプルでいいので、この二次抗体を使って検出できるか試してみてはどうでしょうか？原理的にはきちんとworkする抗体であれば、検出できそうな気がするので、抗体の善し悪しを見る一つの方法になるかも。 　あるいは、お金がかかりますが、総IgE ELISA kitの二次抗体を購入する（バラで売っていれば）って手もあるかもしれません。 　参考になれば幸いです。

詳細です。 削除/引用 No.2224-6 - 2008/11/04 (火) 14:22:15 - クリパン お返事ありがとうございます。 タンパク…食物タンパク 血清…ラットを食物アレルギーに感作させた血清 プレート…マキシソープ処理のnuncプレート 現状…発色試薬を入れても全く発色しません。 　　　ネガコンと同じまたはそれ以下です。 ポジコンは取っていません。 総IgE,特異的IgGは測定しており、どちらも増えているので、 おそらく特異的IgEも増えていると思うのですが… 初心者で全くわからないのですが、必ずしも総IgEや特異的IgGが 増えたからといって、特異的IgEも増える訳ではないのですか？ また、ポジコンになるものがありません。どうすれば良いのでしょうか？ おっしゃる通り、もしかしたら、検出限界以下なのかもしれません。 何か、測定できるキットなどご存知の方いたら教えてください。 ちなみに総IgEはＢＥＴＨＹＬ社のキットを用いて測定しました。

(無題) 削除/引用 No.2224-5 - 2008/11/04 (火) 11:51:08 - まっくろん 　みなさんおっしゃる通り、具体的に「どのように測れないか（どういった現象があらわれているのか）」をお聞きしないことには、何とも言えないですね。標的タンパク、使っているプレート、ポジコンの状態など教えて頂けるとありがたいかと。

(無題) 削除/引用 No.2224-4 - 2008/11/02 (日) 18:06:38 - おお キーワードを置いておきます。 ポジコン 期待値 特異的IgEが発現しない、または存在しない可能性 検出限界以下

(無題) 削除/引用 No.2224-3 - 2008/11/01 (土) 18:41:49 - あう シバヤギのキットなど試してみては？

(無題) 削除/引用 No.2224-2 - 2008/11/01 (土) 17:50:52 - うえっ 情報すくねぇええええええええ ポジコンはどうしてます？

特異的IgEの測定方法を教えてください。 削除/引用 No.2224-1 - 2008/11/01 (土) 17:44:15 - クリパン 特異的IgEが測れなくて困っています。 ELISAでの測定を考えています。 下記の２種類の測定方法を検討しました。 プレートに タンパクを固定 ↓ 一次抗体（血清） ↓ HRP標識二次抗体（抗ラットIgE) ↓ OPD ↓ 硫酸(反応停止） ↓ 490nmで測定 または、 二次抗体（抗ラットIgE)を固定 ↓ 一次抗体（血清） ↓ DIG標識タンパク ↓ ペルオキシダーゼ ↓ OPD ↓ 硫酸(反応停止） ↓ 490nmで測定 この二種類を検討したのですが、測定できません。 どなたか回答お願いします。

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