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(無題) 削除/引用 No.2223-9 - 2008/11/02 (日) 09:07:04 - win ご意見ありがとうございます。リドカインやEDTAでもtryしてみます。 効率よく剥がせるかどうかは、plate coatの種類にも依存すると思うのですが、tissue culture coatでは付着がつよく、non-coatでは洗っているだけですぐ剥がれてしまう印象がありました。 plateはどのような種類を使うのがrecommendされますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2223-8 - 2008/11/01 (土) 21:49:39 - K リドカインを使う方法については、数ヶ月前にこちらで話題になりました。 よく使われる方法ですが、細胞毒性があります。 実験の目的に応じて使われたほうがいいと思います。 （全然考えずに使っている人も多いみたいですけど・・・）

(無題) 削除/引用 No.2223-7 - 2008/11/01 (土) 17:48:10 - うえっ これはいろいろなやり方があります。 トリプシンではがす際に、たとえばサイトカインを加えた直後CD86とかMHC-2とか見ますよね？ しかし、B7 superfamilyに属すものはトリプシンsensitiveで壊れてしまうので基本的にトリプシンは使いません。 某友人のlab (DC屋)では（トリプシンの代わりに）PBSにリドカイン（臨床家ならご存知ですね）加えてはがしてるようです。細胞骨格に影響してはがれるらしいです。このあたりは論文にも出てますので、macrophage ridokineで調べてみてください。 あるいはdishごと4度にしばらくおくとPBSではがれやすくなるらしいです。 しかし、ほとんどのlabではスクレーパーではがしてるようです。けっこう死ぬらしいけど。

(無題) 削除/引用 No.2223-6 - 2008/11/01 (土) 17:45:34 - ami > では付着したマクロファージをFACSにかけるときは、 刺激を少なく剥がすべきになりますが、 どのように剥がせばよろしいでしょうか。 こんだけいろいろぼこぼこに言われてて、調べようとしてみないのは・・・

(無題) 削除/引用 No.2223-5 - 2008/11/01 (土) 17:36:01 - win あきれてものも言えませんといいつつ、詳しく教えていただき誠にありがとうございます。 ちなみに私もアホな教員（MD.PhD.）です（＾＾ 生理学と臨床の論文ばかりで、細胞はド素人ですいません。 では付着したマクロファージをFACSにかけるときは、 刺激を少なく剥がすべきになりますが、 どのように剥がせばよろしいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2223-4 - 2008/11/01 (土) 16:58:17 - うえっ >Lysis bufferを直接加えるのはいい方法ですね。 素人ですいません。トリプシンそのもので刺激になるのですね。 膜蛋白が分解されることでどのようなシグナルが入るのでしょうか？ 付着細胞をsplitするときは毎回その刺激が入っている事になるのでしょうか。 いえ、そういう次元の話をしてるんではなくてorz 膜タンパクが切断されるとどういう刺激がとかいう次元の話ではないんです。 なぜ！！刺激しおえたら「すぐに！！！」その細胞を壊そうとしないのか！！という事です。 うちのポスドク（アホ）も、MAPKを見るとき、細胞をはがしてそのpelletにlysis buffer加えてる［バカ］がいます。 PBSで細胞を洗うのも「刺激」になりますし、トリプシンではがすのも「刺激」になりますし、遠心も「刺激」になるじゃないですか？ つまり、通常の細胞を培養している状態から、離れてしまう操作の事をすべて刺激じゃないですか ？ incubatorの扉を開けるだけでも刺激にならないと思ってるんですか？ あきれてものも言えません（言ってるけど）

(無題) 削除/引用 No.2223-3 - 2008/11/01 (土) 16:35:37 - win Lysis bufferを直接加えるのはいい方法ですね。 素人ですいません。トリプシンそのもので刺激になるのですね。 膜蛋白が分解されることでどのようなシグナルが入るのでしょうか？ 付着細胞をsplitするときは毎回その刺激が入っている事になるのでしょうか。 付着したマクロファージをFACSにかけるときは、どのように剥がせばよろしいでしょうか。聞いてばかりで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2223-2 - 2008/11/01 (土) 16:08:55 - うえっ え？？ ひとつ確認なんですが、サイトカインで刺激したあと、トリプシンではがして細胞を回収してるんですか！！？ それはトリプシンで「刺激」してることにもなりませんか？ 私は、腹腔MΦはサイトカイン刺激後、直接dish or wellにlysis buffer加えてましたが。 ERKとかp38など。 参考まで。

マクロファージのはがし方 削除/引用 No.2223-1 - 2008/11/01 (土) 15:28:33 - win 最近、マウスの腹腔マクロファージの実験をはじめた初心者です。 RPMIで腹腔を洗って、48well plateにまき一時間後にRPMIで3回洗っています。その後、サイトカインで刺激したあとの細胞のlysateでwesternをやりたいのですが、trypsinを使っても細胞がplateについたままなかなかはがれません。リン酸化等を見たいのでできるだけ早く回収しlysisしたいのですが、具体的にどのように細胞を回収すればよいか経験者の方がいらっしゃいましたら教えてください。セルスクレイパーなどを使ったほうが良いのでしょうか？（48wellなので入らなかったのですが、もっと大きなdishなどでやるべきでしょうか。） また、IL-4やTNF-αで刺激しようと思うのですが、刺激するときのmediumはFBSの入った培地で問題ないでしょうか？論文によってはPBS中で刺激していたり、RPMIで刺激したりしています。FBSが阻害することなどもあるのでしょうか。

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