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(無題) 削除/引用 No.2220-14 - 2008/12/02 (火) 12:54:49 - genome ありがとうございます。 はたして、コントロールとしては、どれくらいの範囲が許容範囲なのでしょうか？ たとえば、ノックダウンしたい遺伝子が何％程度落ちてなければよいとか・・　明らかな基準はないと思いますが、皆さんはどうお考えですか？ SiRNAの実験をして思ったのですが、たとえコントロールであっても、実は色々な遺伝子が動いてしまっている可能性がありますよね。結局自分が観察するのは、ノックダウン遺伝子とその影響による遺伝子しか観察しないわけですから、もし、両者が動いていなければ、「コントロールとしてok！」となるわけですよね。 、

(無題) 削除/引用 No.2220-13 - 2008/12/01 (月) 10:35:33 - ＩＲＥＳ lipofection試薬群に比べてnon targeting siRNA群で観察している遺伝子(KDを狙った遺伝子ではなくて)の発現が上昇したのであれば、non targeting siRNAのもつオフターゲット効果やインターフェロン誘導などの影響で観察している遺伝子の発現が上昇している可能性を私は想定したのですが考えられませんか？ 10nMであれば一般的な濃度かと思いますが効きの良いものであれば5nMでもいけた経験があります。それからもう一つの可能性としてはインターフェロン誘導が掛かっている可能性もありますね。invitrogenのステルス修飾がこれを考慮したものだそうですが私は比較したことがないのでわかりません。 コントロールについてはUCさんと同じです。

Re: 削除/引用 No.2220-12 - 2008/12/01 (月) 01:33:03 - UC >論文などに、コントロールSiRNAの配列出ていたりしますでしょうか？あまりみたことないのですが・・・もしそういった論文あったら教えてもらえませんか？ いくつか見かけた覚えはあります。グーグルスカラーで、「sequence control sirna」あたりで検索すると、沢山かかってきます。その中にありそうですが、そこまでは追ってません。

(無題) 削除/引用 No.2220-11 - 2008/11/30 (日) 21:42:55 - コントロール ＩＲＥＳさま＞コントロールさん siRNAはどれくらいの濃度を使用されていますか？ 濃度をKD効果が認められる範囲内で下げるとオフターゲットの影響を下げられる可能性があります 濃度は10nMのSiRNAを用いていますので、結構低い濃度ではないかと思います。 また、オフターゲトというよりは、non targeting SiRNAで遺伝子発現が上昇しているので、オフターゲットのような非特異的な抑制とは、またことなるものではないでしょうか？ 論文などに、コントロールSiRNAの配列出ていたりしますでしょうか？あまりみたことないのですが・・・もしそういった論文あったら教えてもらえませんか？

(無題) 削除/引用 No.2220-10 - 2008/11/30 (日) 18:25:22 - ＩＲＥＳ コントロールさん siRNAはどれくらいの濃度を使用されていますか？ 濃度をKD効果が認められる範囲内で下げるとオフターゲットの影響を下げられる可能性があります。 コントロールの配列を変えるのも手かと思います。 ダーマコンでも幾種類かのコントロールを出していたかと記憶しています。 無ければ論文で公表されているコントロール配列を調べてダーマコンで合成してもらえばよいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2220-9 - 2008/11/30 (日) 07:38:55 - NF 今使っているNON TARGETING SiRNAでストレス応答等の非特異的効果が見られるということですよね。 だったら単純に他のNON TARGETING SiRNAを使ってみては。ダーマコン社に他のものが無ければ、他社のを購入してはどうでしょう。 たとえばInvitrogenのStealth RNAiのネガコンとか。Stealth RNAiの場合、化学修飾してあるみたいなので、ターゲットもStealth RNAiを買って統一しなければいけませんが。

(無題) 削除/引用 No.2220-8 - 2008/11/30 (日) 02:30:10 - コントロール SiRNAのコントロールで困ってこのトピックにたどり着きました。 私は今、ある遺伝子に対するSiRNAの条件設定をしております。 ダーマコン社のＳＭＡＲＴ POOL製品を購入しました。コントロールとしてnon targeting SiRNAを購入して用いました。 目的遺伝子は、後者のNON targeting SiRNAでも少しノックダウンされてしまいましたが、目的遺伝子のSiRNAではもっとノックダウンされていたのでまぁよいかなと思っておりました。 しかし、別の遺伝子発現を測定したところ、NON TARGETING SiRNA投与群においてその遺伝子が高発現となっていました。（トランスフェクション試薬のみ群よりも高値となっていました） NON targetingのはずなのですが、いろいろな遺伝子が動いてしまうようで、コントロートして使いにくいです。こういう場合はどうしたらよいのでしょうか？別のコントロール試薬に変えたり、GAPDH SiRNA投与群をコントロールとしたらよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2220-7 - 2008/11/04 (火) 05:11:52 - GE IRESさんの言うとおり、１−３すべてを網羅するのが一番だと思います。 たいていは、コントロールにLucやGFPの配列、目的のRNAiは２種類以上の配列を用いるのが一般的なストラテジーではないでしょうか。 さらに、目的のRNAi配列の中に数塩基mutationを入れたものをコントロールとして用いたり、また、レスキュー実験を行ったりするとより信頼性が高くなると思います。 RNAi配列が１種類だけだったり、コントロールがしっかりしていないものは、実験者のRNAi実験に対する理解が少なかったり、また、RNAiが一般的になっていない５−１０年前に取ってきたデータをそのまま使っている可能性が考えられると思います。 あと、RNAiの結果だけで作られている論文はそんなに多くないと思います。 たいてい、いろいろな実験手法を用いて結論を導いていると思います。もし、RNAiを用いた実験の寄与が少ない場合、RNAi配列が１種類という場合も見かけると思います。ただ、こういった場合でも、個人的にはしっかりとコントロールを取っていてほしいです。

趣味？ 削除/引用 No.2220-6 - 2008/11/03 (月) 21:48:13 - D 私もＩＲＥＳさんと同意見です この手の質問をする人がいて毎回疑問に思いますが 自分の狙っているレベルの論文を何個か見て それを参考にすればよいだけでは？ 分野によって厳しい分野もあれば どれでもOKな分野もあるでしょうが 趣味で決めてよいものではないと思いますよ コントロールが悪い実験は信用に値しませんから 何をコントロールにしているかというのは 意外と研究者のレベルにも直結しているように思います

(無題) 削除/引用 No.2220-5 - 2008/11/03 (月) 11:15:33 - イｋッコ ありがとうございます。 最近みる論文でも、「liposome」だけを加えたものをcontrolとして、publishされているものも見ますので、どうかなと思っておりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2220-4 - 2008/11/01 (土) 17:51:51 - うえっ 秘密さんの「趣味」には笑えました。

(無題) 削除/引用 No.2220-3 - 2008/11/01 (土) 17:37:03 - ＩＲＥＳ どっちでもよくは無いと思いますよ。 siRNAを使う実験の場合考慮しなければならないのは 1.遺伝子導入試薬による影響 2.本当に興味のあるターゲットのKDによるものなのかどうか(いわゆるオフターゲット効果) 3.siRNAを投与したことによる影響(インターフェロン応答など) 遺伝子導入試薬のみのコントロールでは1.しかカバーしていません。 これらをカバーする為に、non-specific siRNAをコントロールとして用いるべきです。配列はlusiferaseやGFPなど或いはまったく非開示なものなど企業によって様々ですが、用いるsiRNAと同じ製造工程を経たものが良いと思います。 それから一つのターゲットに対して複数の配列を用いて再現性を確認しているか、Dose-responseは有るのか、あるいはsiRNAによって発現に影響を受けない発現系でレスキューされるか否かは大抵コメントされます。

どっちでもいいと思いますよ 削除/引用 No.2220-2 - 2008/11/01 (土) 16:52:59 - 秘密 どっちでもいいと思いますよ。 私の所属している研究室では、non targeting SiRNA、GFP(普通の細胞にはない遺伝子)をターゲットにしたsiRNA、ターゲット配列に変異を入れたものを使っています。 で、その中からどれを使うかは、その人の趣味です。

SiRNA実験でのコントロールについて 削除/引用 No.2220-1 - 2008/11/01 (土) 12:54:04 - イッコ SiRNA実験をするときの、controlって皆様はどうされていますか？ 論文によっては、transfection試薬だけを加えたものをmockとしているものもありますし、ダーマコンやinvitrogenで売っているnon targeting SiRNAをコントロールとしているのもありますし、どちらがいいのでしょうか？

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