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(無題) 削除/引用 No.2213-7 - 2008/11/08 (土) 04:55:56 - Yo 皆様、返信ありがとうございます。泳動サンプルには、ホルムアミドを加えて流しています。それでも、時折、不明なバンドが出現するので、これは何だろうと思っていました。rRNAの可能性、勉強になりました。皆様のご助言を参考に再度各ステップを確認しつつ、泳動してみようと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2213-6 - 2008/11/06 (木) 03:08:09 - おお 多分DNAのコンタミではシャープなバンドは得られないと思います。 たしかにサンプルによってはマイナーですけどシャープなバンドが 見れるととがあります。実際に何かは分からないのですが、rRNAの プリカーサーとか可能性はあるかなと、、、 変性はホルムアミド、ホルムアルデヒド存在下でするプロトコール があります。変性後もホルムアルデヒド非存在下で電気えいどうちゅうに 構造が戻る場合がありますので、えいどう時間を短くする方が無難 とおもいます。15分以下でしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2213-5 - 2008/11/05 (水) 13:10:42 - in situ 泳動前の変性させるときに、ホルムアミドを加えていますか？ 自分も、以前ホルムアミドを加えないで65℃15分変性させていたのですが、これだと変性が不十分みたいで、バンドが汚かったりラダーっぽいものがでてきたりしました。 一度サンプルに等量のホルムアミドを加えて65℃15分変性させてから流してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2213-4 - 2008/11/05 (水) 10:13:39 - Pumpkin 熱変性しなかったり、変性ゲルで流さなかった時など分子量通りの泳動を示さず、綺麗な電気泳動像を得られなかったことがありますが、そこまでひどいということはありません。total RNAがとれたかどうかの確認程度では、TAEアガロースゲルで流しますし。ただ、私はAgilent bioanalyzerで検定してしまうことが多いです。 アプライしている量が多いと、28, 18S以外にもバンドがみられることがあります。もちろん、裁断化されたゲノムの混入の場合も考えられます。その疑いがあるときはDNase処理をかませればよいと思います。 ただ、最初の質問では28Sより上ということでしたが、18と28Sの間にもということになると多少分解が起きていることが考えられると思います。18と28Sの輝度に差が2倍から1.7倍程度あればまだいいかなぁというように思われますが、やはりAgilent bioanalyzerでRINを出しておくとより検定という意味では安心だと思います。260/280の吸光度はあくまで核酸と共雑物の問題なので、分解されているかどうかはわかりませんし、DNAとRNAを区別できませんから。

(無題) 削除/引用 No.2213-3 - 2008/11/05 (水) 06:48:53 - Yo 返信ありがとうございます。泳動前に６５℃で１０分程度サンプルRNAを処理しております。デネイチャー処理をしないと、１８S２８Sの前後にバンドが現れる事があるのでしょうか？サンプルはトライゾルで精製し、２６０／２８０のratioは１．９程度でした。異なる個体由来の全RNAを複数流したのですが、１８S２８Sの間に複数バンドが認められるものと、認められない物がありました。ノーザンなど、10マイクログラム以上のトータルRNAを電気泳動した時、まれにリボゾームRNAの前後にバンドが見られる事があったのですが、そのときは、あまり気にせずそのまま実験していました。RNase処理はサンプル量的には不可能ではないので、最後の手段として行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2213-2 - 2008/11/01 (土) 13:28:43 - やま RNAを流すときはdenatureはしていますか？ ちょっともったいないですが少量をRNAse処理して流してみて そのバンドが消えるかどうかを見るのは無理でしょうか？

total　RNA 電気泳動 削除/引用 No.2213-1 - 2008/10/31 (金) 11:27:34 - Yo ３マイクログラム程度の脳由来total RNAを電気泳動した際、２８SリボゾームRNAよりやや分子量が大きい位置に２、３本のバンドが出る事があるのですが、これはなんでしょうか？ゲノムにしてはサイズが小さいように思われますし。精製がきれいに行われていないのでしょうか？どなたか教えてくださいませ。

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