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(無題) 削除/引用 No.2210-7 - 2008/10/31 (金) 18:05:23 - おお スミになってますが SUMOとかだと、リコンビナントを作ってという仕事はもうすでにあるような気がしますが、、、 試行錯誤もいいかもしれませんが、文献調査やデーターを公表している研究室に聞くなど といったことも考えた方がいいのではないでしょうか。

ありがとうございます 削除/引用 No.2210-6 - 2008/10/31 (金) 10:39:38 - pETSUMO とても勉強になります。ありがとうございます。一度低温でIPTG濃度を下げた条件でやってみようと思います。また、Aさんのおっしゃるようにソニケーションの条件も検討してみようかと思います。それでも無理なら可溶化→リフォールディングを検討してみようと思います。貴重なご意見ありがとうございました。

その他思い当たること 削除/引用 No.2210-5 - 2008/10/31 (金) 00:30:20 - jk 大腸菌のストレインもいくつか特徴的なものがあるのでチェックされても良いかと思います。よくここでも挙がるのが、Rosetta、OrigamiやRosetta-Gami2等の大腸菌です。コドンユーセージは時としてタンパク質発現、フォールディングに影響を与えます。また大腸菌細胞内は強い還元状態にあるので、通常ジスルフィド結合は生じにくいと考えられています。これらを解決するのが上に挙げているストレインです。 あと、タンパク質のフォールディングを促進してくれるものに、BMCと呼ばれる物質があります。非常に有効です。 http://www.dojindo.co.jp/letterj/094/toc_01_main.html 最後に、下に挙げられた発現系の他に、YeastやPichia等もあります。これらは、メンテナンスも楽で目的によっては十分量のタンパク質が得られるので、お奨めです。とくにバキュロは、ご自分で一から立ち上げるのは、骨が折れることもあるかと思いますので、所属されているファシリティで立ち上げているラボがあればまず聞いてみるのが最速です。

(無題) 削除/引用 No.2210-4 - 2008/10/30 (木) 18:12:16 - A ソニケーションをしすぎると熱が発生してタンパク質が変性し沈殿に行くことがあります。念のためですがまずはソニケーションの条件を確認されては？ 不溶性画分に発現しているタンパク質を可溶性画分へ持ってくる条件を検討するにはいくつかの方法があります。しかしそれはどれも涙の阪神ファンさんがおっしゃっているように発現の速度を遅くして正しいホールディングを取らせる時間を稼ぐ方法です。私の経験から知っている方法は １）温度を下げる ２）IPTG濃度を下げる ３）M9のような最小培地で発現させる などです。１）の場合にはあまり変わらないと思いますが１８度を使う人と１６度を使う人がいました。またこのような低い温度の場合、タンパク質発現を１週間かけている人もいました。３）の場合も発現を長めに行っていたように思います。他の方法としては ４）GroELを共発現させる ５）GSTの様な可溶化を助けるタグをつける ６）目的タンパク質が全長であるなら機能ドメインのみ発現系を作る などかと思います。この辺りになるとベクターを代えたりとコンストラクションし直す事になります。また実験系によってはタグを付けられないかもしれません。６）についてはドメインレベルでの話ですが数残基のアミノ酸の違いによってタンパク質の安定度が劇的に変わった（可溶化しやすくなった）例を見たことがありますから可能性はあると思います。ただどのような長さにすれば安定するかの方法論がありませんからこれを目指すには適当な長さのコンストラクションを幾つか準備するしかありません。ただここまでくると結局コンストラクションのやり直しですからEcoRIさんがおっしゃるように大腸菌の系を早々にあきらめて他の発現系に移行するのも一計かと思います。 もし今の発現系をそのまま使うのであれば封入体からのリフォールディングになりますがその条件については界面活性剤からアミノ酸のような小さな分子を使う方法など論文を調べればいくつも方法が出てきますからそれを片っ端から試してみるしかありません。結局この方法は力技ですからそのタンパク質が少量必要なだけなら悪くありませんが多量に必要なのであればお勧めしません。

(無題) 削除/引用 No.2210-3 - 2008/10/30 (木) 16:53:26 - EcoRI 不溶性になってしまったら、可溶性にもっていくための王道はないように思います GuHClやUreaで変性、Arg存在下で透析を繰り返すことで、可溶性になるケースもあります。 当然、そうならないこともあります。 一番手っ取り早くて、可溶性タンパク質が取得できると期待できるのは、 発現系をバキュロか哺乳細胞にするかです。

(無題) 削除/引用 No.2210-2 - 2008/10/30 (木) 16:48:12 - 涙の阪神ファン 不溶性になるのは、翻訳の環境が本来のものとは違っていたりするせいで正しいフォールディングが取れなくって、本来ならば外に出てこない疎水的な配列部分同士がアグリゲーションするということだと考えられるので、温度を低くして翻訳のスピードを遅くすることで正しいフォールディングを取るための時間の猶予を与えるのだとされていると思います。多分に経験的なものなので、本当のところはどうなのか分かりませんが。 個人的には、30℃でほぼ不溶性オンリーだったタンパク質が16℃で半分くらいは可溶性に来たという経験があります。だからと言って完全に正しいフォールディングだったというわけでもなかったようで、可溶性画分を精製したけど比活性は低かったです。

タンパクが不溶性画分に 削除/引用 No.2210-1 - 2008/10/30 (木) 16:38:46 - ｐETSUMO よくわからないことばかりなのでよろしくお願いします。 現在pETSUMOベクターを使用してBL21でタンパクをとろうとしています。 しかし凍結融解の後ソニックをかけてみたら不溶性画分にタンパクがきてしまいます。培養温度を下げるといいとありますが、どうしてよくなるんでしょうか？またこんなことしたらうまくいったなどありましたら教えてください。お願いします。

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