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(無題) 削除/引用 No.221-3 - 2007/09/20 (木) 16:00:37 - かつら 私もスキムミルクということしか分かっていない粉です。普通に使えてます。 前のフォーラムで、ドット状のバックグラウンドには一次・二次抗体を遠心した上清を使うと良いと読んだ記憶があります。 ブロッキングに関しても色々出ていたと思いますので、探してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.221-2 - 2007/09/20 (木) 15:54:12 - K うちのラボでは、どこのものかもわからず、いつ買ったもかも分からないスキムミルクを使ってます。 4℃, O/Nか室温で２時間でブロッキングできます。 ブロッキングの問題というよりは、１次抗体の問題のような気がします。 Protein A カラムでは特異性を考慮しないで IgG が精製されますので、 western における特異性が下がり(表現に違和感を覚えますが)、スポットがでるのだと思います。 抗原(=精製タンパク質)をカラム(GEのNHSとかCNBrとか)に固相化し、これを用いて抗体をアフィニティー精製すると、理論上、抗原に特異性を示す抗体だけが精製されます。 アフィニティー精製抗体を用いて、western をしてみてはいかがでしょうか？

ウェスタンのブロッキング 削除/引用 No.221-1 - 2007/09/20 (木) 14:39:09 - むっかー ウェスタンを行った際にどうしてもメンブレンにドット状のノンスペが出てしまいます。 メンブレンのブロッキング剤にみなさんは何を使っていますか？ 今は森永のスキムミルクを使っています。 また、同じような結果が出た方がいたら、そのときの解決策などを教えて下さい。 ちなみに抗体は自分でタンパク質を精製し抗体作製を業者に依頼しました。 その後、proteinAカラム精製したものを用いて実験を行っています。

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