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(無題) 削除/引用 No.2208-5 - 2008/10/31 (金) 14:33:50 - シーケンス 弘法様、返事ありがとうございます。 ご指摘の通り、最少培地とはSD培地に必要なアミノ酸添加した培地のことです。 使っているプラスミドはマルチコピーなので、教えていただいた方法を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2208-4 - 2008/10/31 (金) 10:18:34 - 弘法 なるほど。 YPDのような非選択培地だとプラスミドが脱落するというのはその通りだと思います。最少培地という言葉でどのような組成を仰っているのか分かりませんが、SDに必要な栄養源のみを足したものをお使いでしたら、SC dropout培地を使えば一日短縮できるかもしれません。 プラスミドの選択マーカーがURA3かTRP1であれば、SDにカザミノ酸を0.5%とアデニン（TRP1ならばウラシルも）を加えたものを使えばさらに生えは良いと思います。 また、ちょっとトリッキーな方法ですが、酵母から調製したDNAをそのままシークエンスするということも可能です。下の文献はゲノムの配列（１コピー）をそのままシークエンスするための方法なので、お使いのプラスミドがマルチコピーなら（理屈の上では）さらに容易かと思います（私自身は経験がありません）。 Horecka J, Jigami Y. Identifying tagged transposon insertion sites in yeast by direct genomic sequencing. Yeast. 2000 Jul;16(10):967-70. PMID: 10870108

(無題) 削除/引用 No.2208-3 - 2008/10/30 (木) 21:07:22 - シーケンス 弘法様、返事ありがとうございます。次回、ダイレクトシーケンスを行なってみようと思います。 １週間かかるといったのは、最初の酵母の培養を最小培地で行なっているため３日くらいかかるからです。 私自身が確かめたわけではないのですが、YPDなどのリッチな培地で培養すれば、プラスミドの脱落が起こりやすいという話を聞きましたので、現在最小培地を用いています。

(無題) 削除/引用 No.2208-2 - 2008/10/30 (木) 15:24:19 - 弘法 酵母から回収したDNAを鋳型に、プラスミドのインサートのみを増幅するPCRをして、その産物をダイレクトシークエンスすれば１日で終わります。 でも、仰ってるやり方でやっても１週間は掛かりすぎでは？ 酵母培養　１日 DNA回収、大腸菌の形質転換　１日 大腸菌培養　１日 プラスミド取りとシークエンス　１日 で、じっくりやっても計４日で出来ますよね。

S. cerevisiaeのプラスミドのDNAシーケンスの方法 削除/引用 No.2208-1 - 2008/10/30 (木) 15:17:24 - シーケンス こんにちは。 S. cerevisiae‐大腸菌のシャトルベクターにつないだインサートの塩基配列を確認しようと考えているのですが、S. cerevisiaeからプラスミド抽出して大腸菌に形質転換し、大腸菌からプラスミド抽出を行い、そのプラスミドを用いてDNA配列を確認しようとしています。しかし、塩基配列決定までに１週間近くかかってしまうため、もっと短期間でできる方法がないか探しております。S. cerevisiaeのプラスミド抽出をした後にそのプラスミドを使う方法もあると思うのですが、純度や収量の問題もありますので、難しいのではないかと思っています。 実際にこのようにしているという方や何かご存知の方はいらっしゃらないでしょうか？よろしくお願いします。

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