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イネの水ストレス下における内部標準遺伝子の選択 トピック削除
No.2199-TOPIC - 2008/10/29 (水) 11:25:03 - イネ
はじめまして。私は、イネを材料に水ストレス条件下での遺伝子発現をリアルタイムPCRで解析しています。分子生物学を始めて間もなく、自力では解決できない問題にぶつかったので質問させていただきます。

水ストレスはマンニトールを使って、浸透圧を調節することによりかけています。現在、内部標準遺伝子を決める予備実験をしています。処理したサンプルと処理しないサンプルを比較すると、変動の小さいとされる１８Sであってもサンプル間にCt値で1.5程度の差が見られます。同一処理内で反復を３とって単なるサンプル間差なのかを調べましたが、同一処理内でのばらつきは非常に小さく，単なるサンプル間差によるものではなく処理間差によるものだと考えられました。また，同一個体から３反復をとって，テクニックの誤差によるものなかについても検討しましたが，こちらのばらつきも小さくテクニックの誤差によるものでもないと考えられました。さらに、ユビキチン、エロンゲーションファクター、アクチン等、他の内部標準遺伝子として使われているものも試しましたが、１８Sと同様の結果になりました。

そこでお伺いしたいのですが、植物にマンニトールで浸透圧ストレスを与え、遺伝子発現を解析されたことがある方はいらっしゃいますでしょうか？もし、いらっしゃいましたら、内部標準遺伝子にどれを用いられたのでしょうか？最後になりますが、この問題を解決するためにすべきことがあれば、アドバイス等いただけると助かります。よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.2199-4 - 2008/10/30 (木) 14:10:50 - イネ
natu様，UC様
お返事ありがとうございます．

natu様
>実験はOne-step法とTwo-step法のどちらでしょう？
>サンプルの定量はどの時点で行っているのでしょうか？

実験はTwo-step法でしており，サンプルの定量はcDNA合成時に
0.1μg／μlになるように調整しています．

>Real-time PCRでは2-3倍程度の差は誤差程度とも言われていますので

これはCt値が１以上違っても誤差程度ということでしょうか？

>1.5倍程度の変化を｢有意｣としている論文もけっこうありますが

どのような論文か教えていただけないでしょうか？

UC様

論文を色々探し，水ストレス下での遺伝子発現解析に使われている
内部標準遺伝子を探し，試しましたが，やはり１８Sと同様の結果に
なりました．もうちょっと調べてみます．

水ストレス処理区のサンプルからRNAを抽出する時（キアゲンのキット
を使っています），Bufferとメルカプトエタノールの混合液に
粉砕したパウダーを入れボルテックスした後の溶液の色を見ると
かなり褐色になっています．コントロールではこの現象は見られません．
そこで，処理区のサンプルにはポリフェノール類が蓄積され，
これがRNA抽出を阻害しているのではないかという考えに至りました．
RNA抽出の際に，きれいにポリフェノールを取り除くには，
やはりCTAB法がベストなのでしょうか？

Re: 削除/引用
No.2199-3 - 2008/10/30 (木) 11:41:48 - UC
こんにちは。natuさんも述べられているように、処理が違えば、トータルのRNA量も違ってくるでしょうし、厳密に、異なる処理サンプル間のRNAやcDNAの量を揃えるのは不可能に近いでしょう（そのための内部標準）。なので、内部標準自体の誤差を評価するのは容易ではなく、複数の内部標準の動向を見て決めるしかないと思います。で、植物は全くの門外漢なのですが、Google Scholarで「plant mannitol water stress PCR control real-time」などで検索すると、論文で何が使われているか情報が得られると思います。

Real-time PCR 削除/引用
No.2199-2 - 2008/10/29 (水) 22:40:23 - natu
実験はOne-step法とTwo-step法のどちらでしょう？
サンプルの定量はどの時点で行っているのでしょうか？
逆転写効率効率がサンプルによって違えば結果も変わってきますよ。

内部標準としては挙げられたようなものが一般的です。
私はアクチン(OsACT1/RAC1)を使ってますが、elongation factorを使っている人もいます。

ただ、内部標準がある程度動くのは仕方が無いと思ってください。
また、目的遺伝子や実験条件にもよりますが、
Real-time PCRでは2-3倍程度の差は誤差程度とも言われていますので、
内部標準のわずかな動きで結果が変動してしまうようでは
その遺伝子の定量は苦しいといえるかもしれません。
(1.5倍程度の変化を｢有意｣としている論文もけっこうありますが)

イネの水ストレス下における内部標準遺伝子の選択 削除/引用
No.2199-1 - 2008/10/29 (水) 11:25:03 - イネ
はじめまして。私は、イネを材料に水ストレス条件下での遺伝子発現をリアルタイムPCRで解析しています。分子生物学を始めて間もなく、自力では解決できない問題にぶつかったので質問させていただきます。

水ストレスはマンニトールを使って、浸透圧を調節することによりかけています。現在、内部標準遺伝子を決める予備実験をしています。処理したサンプルと処理しないサンプルを比較すると、変動の小さいとされる１８Sであってもサンプル間にCt値で1.5程度の差が見られます。同一処理内で反復を３とって単なるサンプル間差なのかを調べましたが、同一処理内でのばらつきは非常に小さく，単なるサンプル間差によるものではなく処理間差によるものだと考えられました。また，同一個体から３反復をとって，テクニックの誤差によるものなかについても検討しましたが，こちらのばらつきも小さくテクニックの誤差によるものでもないと考えられました。さらに、ユビキチン、エロンゲーションファクター、アクチン等、他の内部標準遺伝子として使われているものも試しましたが、１８Sと同様の結果になりました。

そこでお伺いしたいのですが、植物にマンニトールで浸透圧ストレスを与え、遺伝子発現を解析されたことがある方はいらっしゃいますでしょうか？もし、いらっしゃいましたら、内部標準遺伝子にどれを用いられたのでしょうか？最後になりますが、この問題を解決するためにすべきことがあれば、アドバイス等いただけると助かります。よろしくお願い致します。
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