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(無題) 削除/引用 No.2194-13 - 2008/11/04 (火) 20:54:19 - のお fishさま 　Day7でも検討してみたく思います。 　アドバイスありがとうございます。 おおさま 　確かにおっしゃるとおり、そこが研究者の腕の見せ所ですね。 　やってみたいと思います。 　ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2194-12 - 2008/11/02 (日) 18:20:39 - おお >[Re:10] のおさんは書きました : 　 > 　先にクロスリングする場合でしたら、沈降した核fractionをSonicatio用のbufferに懸濁してSonicationすればよろしのでしょうか。 > > 　核fractionを分離後にクロスリンクする場合は、核fractionをbufferか何かに懸濁してホルムアルデヒドでクロスリンクという流れでよろしいでしょうか。 > いずれにしろ途中の過程で核フラクションを取る操作が入るだけであとは本質的には変わりません。 核フラクションを取ったあとのクロスリンクは、細胞全体で処理する条件でやると、ちょっと強すぎるかもしれません。 あとお考えになっている懸念は考えられますが、だれも的確に答えられないと思いますので、ポジコンをなるべく用意して それぞれの条件でやってみてうまく行く方を選べばいいかと思います。 初めてのことをやる場合は、考えられる懸念などを念頭に入れて条件をどのように振って最適な条件をえるかというところが 研究をやっていくうえで重要なスキルとなるともいえます。 みんな初めてやる時は分からないことだらけです。それを踏まえて実行に移してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2194-11 - 2008/11/02 (日) 12:20:13 - fish day10で行われていますが、day7で行われたことはありますか？ 今、思い出したのですが、確かにdayが行き過ぎると回収しずらかった記憶もあります。 通常のadipo-specific geneなどはday7で十分にあがりますし、 PPARgamma, C/EBPalphaなども十分量存在します。 おそらくtarget geneもday7で十分だと思います。 後、私が行った時は、核分離前にダイレクトに細胞をクロスリンクかけていましたが、うまく行きました。 ご参考までに。

ありがとうございます 削除/引用 No.2194-10 - 2008/11/01 (土) 23:44:42 - のお おおさま、あかねさま 　ありがとうございます。是非試してみたいと思います。 　もしよろいければ以下の点もお教えください。 　 　先にクロスリングする場合でしたら、沈降した核fractionをSonicatio用のbufferに懸濁してSonicationすればよろしのでしょうか。 　核fractionを分離後にクロスリンクする場合は、核fractionをbufferか何かに懸濁してホルムアルデヒドでクロスリンクという流れでよろしいでしょうか。 　また、あかね様のおっしゃるようにクロスリンクする前に一連の操作を行った場合、その操作の間にDNA上の結合タンパク質のマップ（挙動）が変化してしまうというようなことはありえないでしょうか。 　よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2194-9 - 2008/10/31 (金) 10:43:44 - あかね おお様がコメントされていますが、すこし補足します。 01. 細胞をPBS wash 2回 02. scrape in PBS 03. 1,500 rpm for 5 min 04. ppt (細胞）に500 ~ 800 ul hypotonic bufferを加える。 hypotonic buffer; 　*20 mM HEPES-KOH (pH7.4) 50 mM KCl 2 mM MgCl2 1 mM EDTA protease inhibitors (complete カクテル） 05. on ice for 10 min 06. homogenize with 30 stroke of Dounce homogenizer (tight fitting pestle) 07. 1/10量の10 x isotonic buffer を加える 10 x sucrose buffer * 0.2 M HEPES (pH 7.4) 1.2 M KoAc 40 mM Mg(oAc)2 50 mM DTT 08. 2,000 rpm for 5 min at 4 C 　　 核fractionはppt, LD&cytoplasm はsup ターゲットのタンパク質の性質にもよりますが、 はじめにクロスリンクするとLDの除去ができませんので、核フラクションを取った後に固定する方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2194-8 - 2008/10/31 (金) 09:38:57 - おお 簡便な核フラクションのとり方は低ちょうなバッファーで細胞をバーストさせて、 核を遠心で回収する方法です。 バッファー等は可也バリエーションがありますが、 10mMぐらいのKClのバッファー(HEPES、TRISや燐酸でpH6.5-8) MgやCa、DTTを1mM前後加えるのがたいていです。 場合によってはTRITON X-100などを0.1%以下加えることもあります。 細胞をこのバッファーでけんだくして、ホモゲナイズし(テフロン とガラスをこすり合わせるようなものとか、20Gニードル中を 何回かとおすなどいろいろな方法がありますが、デタージェント が入ったものではそこまで必要がないと思います)、遠心 してペレットを回収すると核フラクションが沈さにきます。 遠心力もバリエーションがあり、エッペンで最高回転になったら止めるとか ありますが、エッペン用のものだと、2000rpmで5分もすれば完全に回収できます。 今回はクロスリンクさせた後なら核膜を完全にプロテクトする必要もないので TRITON入りのバッファーを作って、細胞をけんだくして、遠心すれば いいかとおもいます。 逆に核をとってから、クロスリンクというてもありますが、条件が細胞の時と 変わると思います。 ノバジェンあたりが、そのようなキットを売っていたと思いますが、、、

ありがとうございます 削除/引用 No.2194-7 - 2008/10/30 (木) 23:38:42 - のお fishさん 　確かに白濁が薄くなってくる印象はあるのですが、透明とまではいきません。遠心するとはっきりと白膜ができてしまします。 おおさん あかねさん 　ありがとうございます。 　勉強不足で申し訳ありませんが、具体的な方法をご存知でしたら教えていただけませんでしょうか。 　よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2194-6 - 2008/10/30 (木) 12:00:22 - fish sonicationで白濁が薄くなっていきませんか？ 若干、白っぽいかんじはありましたよ。しかし、透明でした。 脂肪組織でのChIPはすごく、白濁しましたが、L1はうまくいきましたよ。

(無題) 削除/引用 No.2194-5 - 2008/10/30 (木) 09:45:41 - あかね 以前、脂肪滴の研究をしていました。 白膜は脂肪滴と思って間違いないでしょう。 界面活性剤を入れているので、脂肪滴は中和されるだろうとお思いかもしれませんが、 脂肪滴ってかなり強固で少々のSDSでは溶けません。そして遠心すると軽いので浮いてきて白い膜を作ります。脂肪滴がコンタミしたままの状態でのChip assayはお奨めしません。 おお様がご指摘されている方法が問題をクリアするのにベストだと思います。 脂肪滴は主に細胞質にあるので、細胞質をのぞいたフラクションでChIp assayすべきです。

プロトコール 削除/引用 No.2194-4 - 2008/10/30 (木) 08:20:07 - のお 皆さまありがとうございます。 基本的にはUpstate社のプロトコールに沿って行っています。 ↓細胞を1%HCHO 室温で10分間固定 ↓グリシン（終濃度0.125M）添加、室温で5分間放置 ↓遠心で細胞回収 ↓Lysis buffer(1% SDS、10mM EDTA、50mM Tris-HCl+Protease inhibitor)に 細胞懸濁（懸濁液濃度≒1x10^7cells/mL） ↓氷上で10分間放置 ↓BiorupterでSonication（30sec on/30sec off x15cycle） ↓遠心（12,000rpm、4℃、10min）後上清を新しいチューブに移す というステップですが、最後のところで白濁してしまいます。 （10日間ほど分化誘導して脂肪滴を蓄積した細胞の場合のみです） まずい点はありますでしょうか？ 何かアドバイスいただけましたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

もうちょっと詳しく 削除/引用 No.2194-3 - 2008/10/30 (木) 00:02:20 - DDD Sonicationの段階までのプロトコールが知りたいです。 私もChIP行ってますけど、白濁したりしませんねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.2194-2 - 2008/10/29 (水) 07:58:51 - おお 粗核フラクションを取るステップをどこかに入れればどうでしょうか。

分化3T3-L1でのChIP assay 削除/引用 No.2194-1 - 2008/10/28 (火) 21:41:38 - のお ホルモンカクテルで10日間程度分化誘導した3T3-L1細胞でChIP assayをしたいと考えています。 細胞を固定化後にSonicationにより染色体の断片化を試みているのですが、Sonication後のサンプルを見てみると液が白濁しており、遠心分離（12,000rpm,10min）を行った後の上清にも白濁（油膜？）が認められます。 上清だけを回収したいのですが、どうしても白い油膜のようなものも一緒に回収してしまい困っております。 もし同じような経験をされた方、同じ細胞でアッセイ経験のある方がおられましたら、アドバイスいただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

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