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(無題) 削除/引用 No.2192-14 - 2008/10/30 (木) 22:41:30 - A 私のオリゴのほうが短いようですがこのトッピックの９に書いた内容が参考になるかもしれません。 http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=2048

(無題) 削除/引用 No.2192-13 - 2008/10/29 (水) 14:52:57 - おお プラスミドのセルフランゲーションがおこるようなら、プラスミドの脱燐酸か、オリゴの燐酸かをした方が確実です。あとの操作が(スクリーニングが)非常に楽になります。 アニーリングがうまく行ったかどうかは、電気えいどうしてみるといいかもしれません。で、スメアーであったりマルチプルにバンドが出る時は、目的のサイズを切り出した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2192-12 - 2008/10/29 (水) 04:51:34 - おお あ、実際にセルフライゲーションが取れてこない見たいですが、プラスミドの両末端同士がライゲーションできないように、違う制限酵素で切っているということですよね。 そうであれはベクターの脱燐酸かは必要ないと思います。 そうでなければ１度コンピテントやライゲーションを見直してください。

(無題) 削除/引用 No.2192-11 - 2008/10/29 (水) 04:24:31 - おお >[Re:4] TTさんは書きました : > アニーリングはInvitrogenのOligo annealing Bufferを使ってプロトコール通りに，95℃ 4分→ RT 10分としました。もしこの過程で問題があるようでしたら，ご教示ください。 アニーリングの条件はみなさんの指摘のようにゆっくりと温度を下げていく方がいいかと思います。 ヒートブロックでいいと思いますが、私は500ml-1000mlのビーカーに80-90度のお湯を用意して、 変性処理後、そのビーカーにサンプルをつけておいて、室温放置してます。ほぼ室温(30度とか) になるまで待ちます. というか、そういう方法でやってました。

私の場合 削除/引用 No.2192-10 - 2008/10/29 (水) 02:35:05 - DDD 70bpぐらいのオリゴをアニーリングさせてベクターに組み込むことは よくやってます。 オリゴのアニーリングは94℃10minの後ヒートブロックの電源を落として ゆっくり冷まします。んでゆっくり室温に戻して使用。 ベクターに関してはセルフライゲーションしないことが条件だと思いますね。 もしするならベクターを脱リン酸化する必要があるので オリゴをリン酸化する必要がありますね。。。

(無題) 削除/引用 No.2192-9 - 2008/10/29 (水) 01:34:58 - AP >アニーリングはInvitrogenのOligo annealing Bufferを使ってプロトコール通りに，95℃ 4分→ RT 10分としました。 他の方が指摘しているようにゆっくり時間をかけて冷ましたほうがいいです。 特に90 bpのように長めの配列の対合なら、ゆっくり時間をかけるべきです（サザン・ノーザンハイブリがそうであるように）。 ヒートブロックの加熱をとめて放置のほか、リッター以上の熱湯につけて自然にさめるまで、一晩くらい放置という方法はよくやります。

(無題) 削除/引用 No.2192-8 - 2008/10/29 (水) 01:25:26 - DSC 私の場合は長さ30-40 bpが多いですが、頻繁に行っています。 （１）二本鎖オリゴの末端がプラスミドの制限酵素切断端とコンパチブルになるように設計しますが、あえてライゲーション後に再切断できない配列にしています（再切断する必要もないので）。こうしておけば、ライゲーションの反応液にその制限酵素を微量加えておくことでセルフライゲーションを低く抑えることができます。もちろんオリゴの内部配列を切断しない酵素を選んでそのように設計します。 （２）まず初めに、オリゴを別々に5'-リン酸化するようにしています。アニーリング後に5'-突出末端なら問題ありませんが、平滑あるいは3'-突出末端の場合はリン酸化の効率が悪いらしく、そのいずれであっても、アニール前の単鎖状態でリン酸化した方が効率がよいそうなので。 （３）アニーリングには特別なバッファーは用いず、リン酸化後のオリゴをTEに溶解したものどうしを単に混合しています（最終濃度10 mM each）。ヒートブロックを用いて95℃で5-10分加熱後、スイッチを切り室温になるまで放置しています（アルミブロックなので20分程度はかかります）。とにかく徐冷がよいと信じているもので。アニーリング後に電気泳動して、概ね1バンドであることを確かめます。 （４）制限酵素で切断した（脱リン酸化していない）ベクターとライゲーションします。上述のとおり、ベクターの切断に用いた制限酵素をLigation reactionに微量加えて反応しています。Ligation reaction 10 μLあたり、0.1-0.2 μLくらい。 （５）セルフライゲーションは抑えられる代わりに、2-3個の二本鎖オリゴがコンカテマー状に連なって入ってしまったクローンがよくとれます。プラスミドをチェックする際に制限酵素切断はできないので、もっぱらコロニーPCRの増幅産物で判断します。これにより複数の断片が組み込まれたクローンを排除することもできます。

アドバイスに感謝します 削除/引用 No.2192-4 - 2008/10/29 (水) 00:16:09 - TT 早速のアドバイスに感謝いたします。 ベクターのみをライゲーションした系でもコロニーは出来なかったので，セルフライゲーションはないと思われます。 アニーリングはInvitrogenのOligo annealing Bufferを使ってプロトコール通りに，95℃ 4分→ RT 10分としました。もしこの過程で問題があるようでしたら，ご教示ください。 確かに泳動してませんでしたので，確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.2192-3 - 2008/10/28 (火) 23:44:10 - おお プラスミドのセルフランゲーションがおこるようなら、プラスミドの脱燐酸か、オリゴの燐酸かをした方が確実です。あとの操作が(スクリーニングが)非常に楽になります。 アニーリングがうまく行ったかどうかは、電気えいどうしてみるといいかもしれません。で、スメアーであったりマルチプルにバンドが出る時は、目的のサイズを切り出した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2192-2 - 2008/10/28 (火) 22:48:10 - TS 基本的にはそのままでいけるはずです。 ただし、オリゴの質（精製度）によっては、1:10くらいのほうが入りやすかったりということもありました。 おおざっぱに1:3, 10, 30くらいで振ってやってみたらどうでしょう。 それと、制限酵素の組み合わせによっては、セルフライげーションが結構出ちゃう系だと思いますが、そういうのは出てるんですか？ リン酸化、脱リン酸化を気にするのは、そのあたり次第じゃないでしょうか。 ちなみにアニーリングの条件は問題ないんですよね？

オリゴのライゲーション 削除/引用 No.2192-1 - 2008/10/28 (火) 21:19:27 - TT オリゴをアニーリングさせてプラスミドにライゲーションしようとしているのですが，なかなかうまくいきません。 オリゴは約90bpで粘着末端になるように設計して，プラスミドはMCSの粘着末端を利用しています。 プラスミドは脱リン酸化不要と思って，オリゴにはリン酸化していないのですが，やはりリン酸化したほうがいいのでしょうか？それとも効率が悪いので，通常行っているベクター：インサート＝１：３の比率では低すぎるのでしょうか？ アドバイスいただけましたら幸いです。

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