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(無題) 削除/引用 No.2191-8 - 2008/11/03 (月) 10:59:21 - おお >[Re:7] 齋藤さんは書きました : > あ様　貴重な情報をありがとうございました。 > > ＞細胞増殖の際に薬剤耐性遺伝子を残して，目的の膜タンパクの遺伝子が脱落するということがあるようです． > > この現象について、私も目的の遺伝子が脱落したのではないかと考え、 > 発現の消失したクローンについて、ゲノムを取り出し、ＰＣＲにてインサートの確認したところ、しっかりと目的遺伝子に対応したバンドが確認できました。つまり、脱落ではなく他のファクターによるものではないかと考えています。 いろいろなことが考えられます。 プロモーター部位の脱落。 発現するような組込みがなされた物だけの脱落。 細胞が徐々にキックアウトするので、脱落していないものとキメラになって いてPCRではシグナルが拾える。 脱落でなくてプロモーターがメチレーションなどにより抑制されてしまっている。 とにかく細胞の増殖にあまりよくないものは上記の理由で排除、発現抑制がかかることがあります。

(無題) 削除/引用 No.2191-7 - 2008/11/01 (土) 16:18:33 - 齋藤 あ様　貴重な情報をありがとうございました。 ＞細胞増殖の際に薬剤耐性遺伝子を残して，目的の膜タンパクの遺伝子が脱落するということがあるようです． この現象について、私も目的の遺伝子が脱落したのではないかと考え、 発現の消失したクローンについて、ゲノムを取り出し、ＰＣＲにてインサートの確認したところ、しっかりと目的遺伝子に対応したバンドが確認できました。つまり、脱落ではなく他のファクターによるものではないかと考えています。 現在、再度、ベクターの挿げ替えかセレクションマーカーの変更などを考えています。

(無題) 削除/引用 No.2191-6 - 2008/10/31 (金) 12:45:03 - あ http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4480 私もpcDNA3.1を用いて同様の実験を行っています．膜タンパク発現の確認はFACSではなく，免染とウェスタンで行っていますが，斉藤さんと同様に，最初は膜タンパクの発現が確認できたのに，細胞を一定期間培養した後，再度確認を行うと膜タンパクが発現しなくなっていました． どうやら細胞増殖の際に薬剤耐性遺伝子を残して，目的の膜タンパクの遺伝子が脱落するということがあるようです．プラスミドを細胞にトランスフェクトした際に，プラスミドが細胞のゲノムのどの部分に入るかによって，脱落のしやすさが変わるらしいですが，私も詳しいことはよく分からず，解決法を模索中です．

クローンピックアップ後のシフト消失（FACS解析） 削除/引用 No.2191-5 - 2008/10/29 (水) 07:25:24 - 齋藤 とう様、うーん様、No.2191-4様 ご指摘・ご意見ありがとうございます。 とう様 ＞ウエスタン等で、タンパクの発現は見てられますか？ まだ、ウエスタンでのタンパク発現は確認しておりません。 ウエスタンでの確認も検討を考えておりましたが、現状では陽性クローンのピックアップを優先して行っていました。しかし、やはり一度シフトの無くなったクローンについて確認してみたいと思います。 うーん様 ＞transientの効果により24 wellまで発現は認められるが、抗生剤存在下で長期培養で6 wellになったころには、�@が抗生剤により死んで、�Aが抗生剤により生き残る… ご指摘のように、はじめのうちはそう考えていたのですが、ピックアップした12個のクローンすべてにおいて、同様の現象がみられているため、一部はそうであったとしても、他の原因があるような気がしています。 No.2191-4様 ＞齊藤さんのやり方では、限界希釈の段階でかなりの陰性細胞がでてくる ＞陽性細胞をロスすることも少ない たしかに、ある程度はじめの段階でMACSによる陽性細胞を分離することで、ロスは少なくなると思われ、非常に効率的だと感じました。 No.2191-4様のプロトコールを参考にして、もう一度系を見直したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2191-4 - 2008/10/28 (火) 20:35:04 - - 同じ事をやったことがありますが、 私のやった方法は、 エレクトロポレーション 一週間ほど薬剤セレクション MACSにより膜タンパクの発現が陽性の細胞をsort 限界希釈 でした。 齊藤さんのやり方では、限界希釈の段階でかなりの 陰性細胞がでてくるので、実験の無駄が多いと思われます。 上記のやり方でやれば、陽性細胞をロスすることも少ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2191-3 - 2008/10/28 (火) 19:26:02 - うーん 実はsingleコロニーと思われていたのが、混ざってて、そのうち�@ひとつはplsmid DNAがtransientに入ってて、それでFACSで確認できた。 もうひとつの混ざり物は�Astableにgenomeに組み込まれてるんだけど不幸にもinsertが発現できないような組み込まれ方をした。 で、transientの効果により24 wellまで発現は認められるが、抗生剤存在下で長期培養で6 wellになったころには、�@が抗生剤により死んで、�Aが抗生剤により生き残る… 可能性としては低いですかね？

(無題) 削除/引用 No.2191-2 - 2008/10/28 (火) 19:02:10 - とう ウエスタン等で、タンパクの発現は見てられますか？ つまり ウエスタン→タンパク見える→ FACSで見えない？ 　　　　　　　　　　　　　→　　　 見える? どちらですか？

クローンピックアップ後のシフト消失（FACS解析） 削除/引用 No.2191-1 - 2008/10/28 (火) 18:53:12 - 齋藤 はじめまして、齋藤と申します。 いつも参考にさせて頂いております。 現在、とある膜タンパクの安定発現株を樹立したいと考えております。 今回、pcDNA3.1に目的とする膜タンパクの配列を入れたプラスミドを作製し、エレクトロポレーションによるトランスフェクションを行いました。 トランスフェクション後、96wellプレートで限外希釈法および薬剤セレクションを行い、クローンのピックアップを行っています。 その際、96wellよりピックアップしたクローンの一部は24wellで培養し、残りをFACSを用いて、目的とする膜タンパク発現の確認をしています。 しかし、96well→24wellの段階では目的とする膜タンパクの発現（単色：ピークのシフト）が確認できたのですが、次の段階である24well→6wellにスケールアップしたとき、同様にFACSにより膜タンパクの発現を確認すると、以前確認できたピークのシフトが消失してしまうという問題に直面しています。 同様の御経験をされた方や対処法をご存知の方がいらっしゃいましたら、御教授お願い申し上げます。 ちなみに、96well, 24well, 6wellにおける培養時も薬剤によるセレクションは続けています。 なにぶん私はトランスフェクションによる安定株の樹立は初めてのことで、まだ経験・勉強不足のところが否めませんが、よろしくお願い致します。

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