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(無題) 削除/引用 No.2190-3 - 2008/10/28 (火) 13:02:30 - am ダイマーと、非特異産物が無いかの確認ですね。 融解曲線分析で1ピークであってもアガゲルで見たらバンドが2本･･･ということもありえます。 あと、段階希釈したものが適切な間隔（2倍違いなら1サイクル、10倍違いなら3.3サイクル）でシグナルが立ち上がっているかを確認することでPCR効率を確認できます。 いかがでしょうか･･･。

(無題) 削除/引用 No.2190-2 - 2008/10/28 (火) 12:55:34 - student 一応聞いておきますが、 プライマーダイマーがないことは確認されてますよね？

real time PCRで２段階の増幅のなぜについて 削除/引用 No.2190-1 - 2008/10/28 (火) 10:11:17 - 教えてください。 いつも大変勉強させていただいております。 以前からreal time PCR (SYBR Green)を行ってきたのですが、見る遺伝子によって、増幅が２段階になる事があり困っています。 actinやGAPDHはもちろん30 cycle前後で上がってくる発現量の低い遺伝子でも、きれいに行くものは再現よく増幅します。 しかし、某遺伝子に関しては各サイクルごとの増幅（蛍光強度）を見ますと、二段階になっています。 しかし、同じprimerでも別の日に同じsampleをreal time PCRすると一段階で行く場合もあります。 ですので、primer自体は問題ないと考えています。 ちなみに２段階増幅、一段階増幅したPCRの産物(40 cyclesまで)を電気泳動するとどちらも予想通りの同じ高さのbandがsingle bandとして出ます。 なんなのでしょうか？ このような経験に遭遇してしまわれた方がおられましたら、どのように対処してこれを改善したか、教えていただけると本当に助かります。 言えることは、特定の遺伝子によってこのようなことが頻発するということです。。

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