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(無題) 削除/引用 No.2185-9 - 2008/10/29 (水) 14:44:04 - ogu すいません。私の記載が不足していました。 当研究室で、２０％パラホルムアルデヒドを10ml調製（PFA粉末2g）する場合は10M NaOHを10μlほど使っています。 AP様とほぼ同量です。 そのため、PBSで希釈して4％を調製しても問題なかったのだと思います。 皆様の話をきけてとても勉強になりました。ありがとうございます。 念のため、次回４％を調製するときは簡易試験紙でpHを確認してみようかと思います。 0.1M リン酸バッファーを使ったプロトコールもあわせて検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2185-8 - 2008/10/27 (月) 13:51:06 - AP 参考までに、実際にPFA水溶液を作ったときの経験をもとにして作った、私のレシピでは、1 g PFAにつき約5 uLの10 M NaOHを標準としています。 20% PFAで10 mMのNaOHとなります。これを5倍希釈して4% PFAにしたとき、2 mM NaOHですので、10 mM リン酸バッファーのPBSでも許容範囲だろうと思っています。

補足 削除/引用 No.2185-7 - 2008/10/27 (月) 11:42:13 - ぽすどく 　すみません、先ほどの自分の書き込みを見て、少しわかりにくかったかと思うので念のため補足します。（伝わっているような気はしているのですが念のためです） 　免疫染色用のPBS中のリン酸濃度は0.01Mのことが多いと思います。これでは1N NaOHを中和するのに（0.1M PBと比べて）少し不安なのかなと思っています。 　文章が下手ですみませんでした。 　・・・あくまで一意見です。

(無題) 削除/引用 No.2185-6 - 2008/10/27 (月) 11:38:59 - 組織 直接比べた訳ではないないですが、一般的にはPFA/PBの方が固定力が強いといわれています。ただ劇的に変わるものでもないと思うので、今問題がないのであれば、プロトコールを変えなくてもいいんじゃないでしょうか。 関連トピック　http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=336 PFAの調製方法については、ご指摘があるように、まず水溶液で作るのが一般的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2185-5 - 2008/10/27 (月) 09:44:07 - AP >４％パラホルムアルデヒドは使用前日に２０％／PBSで作製し これで、きれいに溶けきりますか？　かなり溶け残りがあってやや白濁しているのではないでしょうか。フィルターで取り除いているのかな。 PFAは水に溶けにくく、加熱しても完全に溶かしきるのは難しいです。NaOHを加えた方がきれいに溶けます。しかし、バッファーに溶かしているときはNaOHを加えても緩衝されて効果が望めません。 私は、まず8-20%の水溶液にします。加熱だけで溶けるだけ溶かしてから、溶け残りがなくなるまで少量ずつNaOHを加えながらさらに溶かします。これならpHを極端にあげることなく（だいたい、できあがりはpH 8台以下です）ほとんど溶け残りが見えなく位まで溶けます。一応、仕上げに濾過はします。 使用時はPBSで調製しています。 PBSにするかPBにするかは、好みの問題だけだと思います。 固定が効くまで組織や細胞は生きているので、なるべくショックを与えないために、PBSのほうが良さそうな印象はあります。 参考までにSigmaのinstruction (pdf) http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich/product_information_sheet/p6148pis.pdf

(無題) 削除/引用 No.2185-4 - 2008/10/27 (月) 08:13:04 - ogu 回答ありがとうございます。 言われてみれば仰るとおりです。 下記の野地澄晴先生のプロトコールでは、脱イオン水に数滴のNaOHで溶かして20%PFAにしています。 その後、リン酸バッファーを加えて4％にするわけですから、ぽすどく様の仰る通りなのかもしれません。 4%の使用前に、pHを確認してみることにします。 pHをリン酸バッファーで戻しても、PFAが析出してこないということは、NaOHを使わないと調製できないというわけではないのでしょうか。 20%PFAの調製は、NaOHを加えずに60℃で長時間加熱とかでどうにかなるものでしょうか？ あわせて検討してみたいと思います。ありがとうございました。

NaOH? 削除/引用 No.2185-2 - 2008/10/27 (月) 04:23:19 - ぽすどく 　私は0.1M PBを使っています（最終濃度として）。自分の中でつけている説明は以下です。 　PFAは水（と言ってもお湯）にまず溶かすことが多いと思います。このときに、１N NaOHを数滴添加し、後にBufferで中和します。この場合、免疫染色で用いるような0.01MのPBでは心もとないのではないかと（勝手に）考えています。 　NaClの有無はあまり関係ないように思います。上記のように、リン酸の濃度の方が重要と思います。（ちなみに、私はSucrose液にNaClは入れませんが、別に大した意味はないです> 　あくまで一意見です。他の方の意見も聞きたいところです。

凍結切片固定法（4%PFA調製は0.1Mリン酸バッファーかPBSか？） 削除/引用 No.2185-1 - 2008/10/26 (日) 23:18:35 - ogu 凍結切片・免疫染色の初心者です。 私のラボでは組織の固定は４％パラホルムアルデヒド,4℃,オーバーナイト（必要に応じて潅流固定）で行っています。 ４％パラホルムアルデヒドは使用前日に２０％／PBSで作製し、当日に4%になるようにPBSで希釈します。 置換はスクロース/PBSで行います。 このプロトコールで問題は発生していません。 しかし最近、『免疫染色 & in situハイブリダイゼーション最新プロトコール』（野地 澄晴/編,羊土社,2006）を読み直しました。 この本では、20%パラホルムアルデヒドを脱イオン水＋10M NaOH数滴で60℃にインキュベート、そして4℃冷暗所保存。 使用当日、0.1Mリン酸バッファーで希釈して使用しています。 スクロース置換の時は、スクロース/PBSを使用しています。 前置きが長くなりましたが、質問です。 0.1Mリン酸バッファーと、PBSを分ける意味はなんですか？ 両者ともPBSで統一した方が簡単だと思いますが、何か理由があるように思えてならないのです。 使い分ける利点など、おわかりになる方がいれば教えて頂ければ嬉しいです。 ------------------------------- 組成 ◇リン酸バッファー 調製：A液23ml＋B液77ml＋100ml超純水 A液：0.2M NaH2PO4・H20 B液：0.2M Na2HPO4・2H2O ◇PBS Na2HPO4・12H2O 　2.9g　（最終濃度：8.10mM） KH2PO4 0.2g　（　　　　：1.47mM） NaCl 　 8g　（　　　 ：137mM） KCl 0.2g　（　　 ：2.68mM）　 超純水　　　　　　　 1000ml、pH7.4

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