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(無題) 削除/引用 No.2184-4 - 2008/10/26 (日) 17:47:26 - EcoRI プロテアーゼインヒビターを入れて、液体窒素で急速凍結、-80度で保存です。 (徐々に凍結すると、氷の結晶がダメージの原因になるとかならないとか。あれ？それは大腸菌だっけ？) 融解するときは、室温の水で完全融解寸前(小さな氷が残っている)まで溶かして、 あとは氷上で溶かします。 凍結and/or融解は、多かれ少なかれタンパク質にダメージ(変性、分解)を与えることを覚えておけばいいでしょう。 私なら、時間的な余裕があるときに、一気に精製までかけてしまいます。

(無題) 削除/引用 No.2184-3 - 2008/10/26 (日) 16:58:34 - ~ 1 保存する必要があれば、私なら冷凍保存します。違いは無いと思いますが、-80度のディープフリーザーに入れるでしょう。 そして、融解後に遠心してdebrisを除いて、0.2umのフィルターに通してからカラムにかけます。(これはカラムの保護が目的ですが) プロテアソームインヒビターカクテルも、凍結前におまじない代わりに入れておきます。 本当にやるのであれば、私なら精製時に合わせてタンパク質を取り直す準備も合わせてしておきます。 2 これは、何の目的で、どのような組み合わせで精製する実験ですか？ 溶出条件でelutionできるカラムを使うのであれば、わざわざ濃縮するメリットは、冷凍庫の場所の節約以外には無いと思っています。 ゲルろ過は、1番目の精製方法としては、あまりいい方法だと思っていません。

(無題) 削除/引用 No.2184-2 - 2008/10/26 (日) 15:13:37 - おお もし、硫安で沈澱できるなら、沈殿させてそのペレットを-80度とか低温で保存するのもてかもしれません。 すでにその活性のアッセイ系があるなら凍結に耐えうるか少量でテストするといいかもしれません(硫安の場合もそうですね)。 プロテアーゼ阻害剤は入れるほうがいいと思います。 限外濾過で濃縮をする人も居ると思いますが、私ならイオン交換とかで吸着しておいて、一気にはがして濃縮すると同時に粗製せいをして、なるべく凍結した状態で取っておくとかするかも知れません。 4度保存で平気なものもあるとはおもいますが、精製したら分解してましたでは目も充てられませんので、、、 慎重にやるにこしたことはないと思います。

カラム精製前のタンパクは・・ 削除/引用 No.2184-1 - 2008/10/26 (日) 14:55:46 - くー 昆虫細胞のバキュロウイルス発現系で得た分泌性タンパク質をカラム精製する予定ですが、幾つか疑問点がありますので、お答えいただけると嬉しいです。 �@すぐにカラム精製することがどうしても難しい場合、分泌性タンパク質の含まれる培養上清は、�Aの方法でろ過＆濃縮後、4℃保存で宜しいでしょうか？（←1ヶ月未満の予定ですが） 長期保存となると、やはり凍結保存させた方がいいのでしょうか？また、何か試薬（プロテアーゼインヒビター？）を加えた方がいいのでしょうか？ �Aカラム精製前にろ過＆濃縮は行った方が良いかと思うのですが、その場合、どんな方法（遠心？限外ろ過？）が適していますでしょうか？ 実際によく行われている方法などありましたら、教えていただきたいです。ちなみに元の培養上清は200−500mLの予定です。

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