全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございました 削除/引用 No.2177-11 - 2008/11/16 (日) 12:50:07 - マウス実験初心者です 先生方 マウス実験初心者です。 先日、マウス腹腔マクロファージの細胞表面抗原について、FACSによるマルチカラー解析を試みましたが、その際に得られた問題点に関しまして、ご意見、ご助言をお願い申し上げました。 このたび、問題点が無事に解決いたしましたのでお知らせ申し上げます。 先生方のご意見、ご助言を参考に、次の条件でマクロファージの染色反応をおこないました。 ・アジ化ナトリウムを添加（最終濃度0.1%）した反応液、washing bufferを用いる ・Blockingをしっかりおこなう（今回は、10%マウス血清で、4℃、30分間おこないました） ・一次抗体の濃度を下げる（3 ng/ulでおこないました） ・ストレプトアビジンのみの反応も確認する その結果、ネガティブコントロールとして、アイソタイプが同じビオチン化抗体を用いた場合、染色反応をしていない場合に比べて、ほぼ同じドットプロットパターンが得られ、「ネガティブコントロールの反応でも30%近くの細胞が陽性を示す」という問題を改善することができました。 一方、F4/80等の抗体を用いた場合には、文献で報告されているのと同様なパターンを得ることができました。 また、ストレプトアビジンのみでの反応もおこないましたが、染色反応をしていない場合と同様のパターンが得られましたので、ご指摘の通り、一次抗体の問題だったと考えております。 ただ、3回に1回、ネガティブコントロール反応でも5〜10%の陽性シグナルが出現することがありましたので、一次抗体の濃度をもう少し下げるのが望ましいかと考えているところです。 お忙しい中、ご意見、ご助言をありがとうございました。 重ねてお礼申し上げます。 これからもよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2177-10 - 2008/10/29 (水) 16:14:19 - DC ＞ほう様 説明不足でした。すみません。 Azとは、アジ化ナトリウム (Sodium Azide) のつもりで書いておりました。

DC様 削除/引用 No.2177-9 - 2008/10/28 (火) 17:14:43 - マウス実験初心者です DC様 あたたかいご助言、ありがとうございます。 抗体反応は4℃でおこなっております。 抗体反応液ですが、Azを入れております。 DC様のご指摘のように、マクロファージの強い貪食活性による取り込みの可能性は、確かにその通りだと思いました。 ですが、まだまだ勉強不足のため、ご指摘があるまで、そこまでイメージができておりませんでした。 ただ、キャッピングを防ぐためにはアジ化ナトリウムを加えた方がよいというアドバイスを受けたことがあり、0.1%の最終濃度になるように、抗体反応液、及びwash bufferに添加しております。 DC様からのご助言を受け、あらためてその必要性を感じましたので、今後とも引き続き添加したものを用いていこうと考えております。 先日の先生方からのご助言も合わせ、次は、一次抗体の濃度を下げて（まずは3 ng/ulを考えております）、ストレプトアビジンのみの反応も検討する予定です。 お忙しい中、あたたかいご助言、あらためてお礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2177-8 - 2008/10/28 (火) 16:14:49 - ほう DCさん 横から失礼します。 Azについて教えていただけないでしょうか？ azideのことではないですよね？

(無題) 削除/引用 No.2177-7 - 2008/10/28 (火) 14:39:01 - DC 余計な指摘かもしれませんが・・・ 抗体反応は4℃で行なっていますよね・・・？ 抗体反応液にはAzは入っていますか？ Mφは非常に強い貪食活性を持っているので、室温での反応やAzのようなエネルギー代謝系阻害剤を入れていない場合にはMφがビオチン化抗体やアビジンを貪食しているせいでノンスペとして見えている可能性も考えられます。 みなさんの仰るように、１次抗体なしでも光ってしまうようでしたら、この辺も確認してみるといいと思います。

よっしー様、まっくろん様 削除/引用 No.2177-6 - 2008/10/24 (金) 15:49:27 - マウス実験初心者です よっしー様、まっくろん様 あたたかいご意見、ご助言、ありがとうございます。 よっしー様 一次抗体なしでストレプトアビジンのみでの反応は、まだ検討しておりません。よっしー様のご意見のように、一次抗体の問題かどうかをはっきりさせるためにも、次回は検討することを予定しております。 まっくろん様 この抗体は市販品で、FACSにも適用可能となっております。使用濃度ですが、推奨濃度の最大値を試していました。まっくろん様のご助言のように、次回は、Fcブロックの時間を長くするとともに、一次抗体の濃度を下げるということを、上記ストレプトアビジンのみでの反応とあわせて、検討したいと考えております。 お忙しい中、ご意見、ご助言、重ねてお礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2177-5 - 2008/10/24 (金) 13:48:16 - まっくろん 　よっしーさんのご指摘のように、私も1次抗体（isotypeの）のノンスペを最初に疑うべきだと思います。 　Fcブロックの時間を長くするか、1次抗体の濃度を下げてみてはどうでしょう？この抗体は、自作ですか？それとも市販品でしょうか？市販品であれば、1×10^5 cellに対して、15 ng/ul（50ulとして0.75ug, 100ulで1.5ug）は、抗体量が多めの感じがしますが・・・。そういう抗体なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2177-4 - 2008/10/24 (金) 13:46:45 - よっしー 一次抗体無しでストレプトアビジンのみで反応させた時， 細胞は光りますか？ 光らないのでしたら，一次抗体の問題だと思います． 一次抗体を蛍光標識しても，結果は変わらないと思います．

よっしー様 削除/引用 No.2177-3 - 2008/10/24 (金) 13:21:39 - マウス実験初心者です お世話になります。 一次抗体の由来動物種はラットになります。 ラットIgG2a（ビオチン化済み）で、1 x 10(5乗)cellsに対し、15 ng/マイクロリットル、4℃、15分間の反応を行っております。 それではよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.2177-2 - 2008/10/24 (金) 13:08:48 - よっしー 本当にストレプトアビジンが直接マクロファージに付いているのですか？ 今までそんなことに遭遇したことないのですが・・・． 一次抗体がFcRに付いたのではないでしょうか？ 一次抗体の由来動物種は何ですか？

マウスマクロファージのFACS解析について 削除/引用 No.2177-1 - 2008/10/24 (金) 12:05:56 - マウス実験初心者です マウス実験初心者です。よろしくお願い申し上げます。 マウス腹腔マクロファージの細胞表面抗原について、FACSによるマルチカラー解析をこころみています。 ですが、ビオチン化されている一次抗体を用い、ストレプトアビジンが結合している蛍光色素で検出しようとしたところ、問題が起きました。 ネガティブコントロールとして、アイソタイプが同じビオチン化抗体を用いた場合にも、染色反応をしていない場合に比べて、30%近くの細胞が陽性を示すという結果が得られたのです。 抗体による染色反応をする前には、10%マウス血清でブロッキング反応をおこなっているのにもかかわらず、ネガティブコントロールのサンプルで陽性集団が出てきてしまいましたので、マクロファージ表面にはアビジンと結合するような物質があるのだろうかと危惧しています。 マウス腹腔マクロファージの場合、ビオチンとアビジンの結合を利用した２ステップ染色ではなく、蛍光色素が結合している一次抗体を用いる１ステップ染色をおこなう必要があるのでしょうか。 どのようなことでも、ご意見、ご助言、お気づきの点がございましたら、ご指摘、ご教示くださいますよう、よろしくお願い申し上げます。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---