全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2168-12 - 2008/10/24 (金) 19:56:07 - 初心者 ~様、k様、きねーしょん様 皆様のアドバイス誠にありがとうございます。非常に参考になりました。 皆様の指摘が根本的なものだろうと思います。 増殖抑制遺伝子stableの樹立には、IRESベクターを使用しても、サイレンシングの影響が強く出る場合があるなら、やはり発現誘導系の方が確実に取れるということですね。 ~様おっしゃったように「今のポリクローンから20~30クローンを取得 トランスフェクションをやり直して、再現性が見られるかを確認 しながら誘導プロモーターも検討されてはいかがでしょうか。」で再挑戦していきたいと思います。 大変勉強になりました。皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2168-11 - 2008/10/24 (金) 11:50:49 - ~ おそらく抗タグ抗体と抗目的産物抗体でのWBの結果の違いは、Kさんのおっしゃれているように感度の違いでしょう。 ただ、本当の問題は、増殖抑制遺伝子を恒常的に発現させようとしているところだと思います。 おそらく2~3週間セレクションしている間に、増殖出来る程度の低発現の細胞(と全く発現していない細胞)が得られてきているのだと思います。 もし、高発現している細胞が必要なのであれば、 一過性の発現で実験するか、発現誘導できるようにするのが効果的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2168-10 - 2008/10/23 (木) 22:30:21 - K 初心者様 おそらく発現しているtagつきのタンパク質が内在性のタンパク質に比べて極端に少量しか存在していないのだと思います。 tagを認識する抗体は感度が強いので少量のタンパク質でもそれなりのバンドとして検出されますが、内在性の抗体で確認するにはtagつきのタンパクは発現が弱すぎ、かつ内在性のタンパクに対して相対的に微量であるということではないでしょうか？ 残念ながら私の予想ではそれくらいしか思いつかないです。他に考えられることがありましたらどなたかフォローをお願いします。 きねーしょん様 ご指摘ありがとうございます。私の説明不足で申し訳ありません。 おっしゃる通りIRES vectorも万能ではないと思います。ただ別々のプロモーターを使用するより、目的の遺伝子の転写量と薬剤への耐性度が比例関係になりやすいので、選抜する薬剤の濃度を高くしていけば全く発現しないようなクローンは少なくなると考えました。逆にタンパクの毒性が強ければクローンがまったくとれないということもありえますが・・・　そのときは誘導発現系が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2168-9 - 2008/10/23 (木) 21:20:42 - きねーしょん IRESベクターを使用しても、サイレンシングの影響が強く出る場合がありませんか？ IRESは、万能とは言えない気がします。

(無題) 削除/引用 No.2168-8 - 2008/10/23 (木) 21:06:36 - 初心者 >[Re:7] えっ？さんは書きました : > tagは目的遺伝子に融合してあるのですよね？ > > 目的遺伝子が発現していなくてtagが発現しているとはどういう状態を仰ってるんですか？ westernで目的遺伝子の抗体やtagの抗体で発現確認をしてみました。 tagの抗体で見るとき、分子量＝（目的遺伝子＋tag）のバンドが見られていましたが、目的遺伝子の抗体で見るとき内在性の遺伝子発現しか見られませんでした。 最初いっかせい発現するとき、内在性遺伝子も導入された遺伝子も発現していましたが。

(無題) 削除/引用 No.2168-7 - 2008/10/23 (木) 20:46:13 - えっ？ tagは目的遺伝子に融合してあるのですよね？ 目的遺伝子が発現していなくてtagが発現しているとはどういう状態を仰ってるんですか？

(無題) 削除/引用 No.2168-6 - 2008/10/23 (木) 20:14:59 - 初心者 K様 助言ありがとうございました。大変勉強になりました。 > stableの樹立に用いているplasmidは目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子が別々のプロモーターから転写されているものでしょうか？ > そのようなplasmidで細胞の増殖に不利な遺伝子の過剰発現株を取ろうとすると、目的の遺伝子のプロモーターがメチル化などにより強く抑制されたクローンや、ゲノムにインテグレートされる際に薬剤耐性遺伝子のみが正確に組み込まれたものが優先的に増殖出来るため、目的の遺伝子を過剰に発現している細胞はどんどん淘汰されていなくなってしまいます。 確かに、目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子が別々のプロモーターから転写されています。 ただ、ご説明が足りなく、申し訳ありませんが、目的遺伝子と同じのプロモーターから転写されるtagの方は発現し続けているのはどう解釈すれば良いのでしょうか？ ご教授よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2168-5 - 2008/10/23 (木) 18:12:16 - K stableの樹立に用いているplasmidは目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子が別々のプロモーターから転写されているものでしょうか？ そのようなplasmidで細胞の増殖に不利な遺伝子の過剰発現株を取ろうとすると、目的の遺伝子のプロモーターがメチル化などにより強く抑制されたクローンや、ゲノムにインテグレートされる際に薬剤耐性遺伝子のみが正確に組み込まれたものが優先的に増殖出来るため、目的の遺伝子を過剰に発現している細胞はどんどん淘汰されていなくなってしまいます。 解決方法としては誘導発現系の使用、IRES等を用いて目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子を同一のプロモーターから転写させる系の使用、高タイターのレトロウイルスやレンチウイルスの使用等が考えられると思います。

(無題) 削除/引用 No.2168-4 - 2008/10/23 (木) 16:59:55 - ~ >どんな仕組みで導入遺伝子部分だけを壊していて、薬剤耐性とタッグの発現を残されたのでしょうか？ ゲノムにインテグレートされる際に、どこで千切れて入るかは、誰にも分かりません。 また、メチル化などでサイレンシングが起きているのかもしれません。 >この遺伝子は別の細胞導入した過剰発現細胞株は既に論文で報告されていますが、用いた細胞による取れない可能性もあるのでしょうか？ 現実を見ましょう。 その増殖抑制遺伝子のパスウェイが同じかどうかは、 調べれば分かるかもしれません。 まずは、論文と同じ細胞でも試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2168-3 - 2008/10/23 (木) 16:05:40 - 初心者 ~様ありがとうございます。 > 気になるのは、発現させている遺伝子は、細胞の増殖に負に働くようなものではありませんか？ ~さんのおっしゃるとおりです。増殖抑制遺伝子を発現させています。 > そのために、薬剤耐性は残っているが、 > 導入遺伝子部分は壊れているか、発現が抑えられているようなpolycolneをとってきているような気がします。 この理由は良く分かりません。どんな仕組みで導入遺伝子部分だけを壊していて、薬剤耐性とタッグの発現を残されたのでしょうか？ この遺伝子は別の細胞導入した過剰発現細胞株は既に論文で報告されていますが、用いた細胞による取れない可能性もあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2168-2 - 2008/10/23 (木) 15:27:14 - ~ >Polycloneの発現確認　（発現は殆んど無くなった） 高発現クローンが欲しいのであれば、この時点で止めるべきかと思います。 気になるのは、発現させている遺伝子は、細胞の増殖に負に働くようなものではありませんか？ そのために、薬剤耐性は残っているが、 導入遺伝子部分は壊れているか、発現が抑えられているようなpolycolneをとってきているような気がします。 本当にそのようなことがおきているのかは分かりませんので、 今のポリクローンから20~30クローンを取得 トランスフェクションをやり直して、再現性が見られるかを確認 しながら誘導プロモーターも検討されてはいかがでしょうか。

ステイブルをクローニングについて 削除/引用 No.2168-1 - 2008/10/23 (木) 15:09:00 - 初心者 ステイブルをクローニングをしている最中ですが、最初いっかせいの発現はかなり良かったなのに、薬剤で2−3週間セレクションしてから発現を確認していたが時、発現は落ちていて、wild typeと殆んど代わりがありません。細胞は元気に増えていますが、、、、 この場合、どう解釈すればよいのでしょうか？このままクローニングを進めていいか悩んでしまいます。 是非ご助言いただけたら幸いです。 Plasmid導入 ↓ 24-48時間で発現確認（よく発現していた） ↓ 薬剤で2−3週間セレクション ↓ Polycloneの発現確認　（発現は殆んど無くなった） ↓ トリプシン処理で剥がして限界希釈法でシングルクローンを取る

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---