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(無題) 削除/引用 No.2164-6 - 2008/10/29 (水) 09:29:00 - ぴーしーあ アプライドに問い合わせてみたところ、サイバーグリーンとTAQMANでそれほど大きく感度に差はないといわれました。またtotal反応液量を増やすと検出できることがあるとおそわりました。 実際のところどうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2164-5 - 2008/10/23 (木) 21:41:47 - ひちみ SYBRのほうが原理上感度は稼げますが、特異度を保証するのが大変です。 マイクロダイセクションだとRNAの断片化が避けられないので、2ステップ系だと定量性にも疑問があります。 ＃1ステップについては知識がないのでコメント回避。 そもそも定量PCRの目的は何でしょうか？ ABIのTaqmanをお使いでしたら、それ用のプレPCRキットが発売されてます。

(無題) 削除/引用 No.2164-4 - 2008/10/23 (木) 10:50:44 - ピーシーアール ありがとうございます。 ポジコンは出ております。 別のスレでご意見いただきましたが、検出できたものもCT値がかなり高くもともとの発現量も少ないのかと思われます。 何か感度を上げる良い方法はないでしょうか？Taqmanはノンスペを拾わないので特異度は高いようですが、感度もサイバーグリーンより勝るのでしょうか（そうであればTaqmanのネックは値段くらいなのでしょうか）？

一度はレスをつけておいて失礼しました。 削除/引用 No.2164-3 - 2008/10/23 (木) 10:15:28 - mom-a 質問が混ざってわかりにくくなりそうでしたので…。 収量以外に、マイクロダイセクションしたサンプルに特有の問題があるのかどうか、私にはわかりません。それ以外で思いつくことというと… うーんさんのおっしゃるように、リアルタイムの系が動いていない可能性はないですか？RTで35サイクルでかなり薄いバンド、ということはもともと発現量が少ないのですね。もっと発現量の多いサンプル（マイクロダイセクションでなくても）で系が動くかどうか確認できないですか？ 系が動いているなら、サイクル数をあげれば検出はできそうに思います。前に書きましたが、1コピーを検出するには最低でもトリプリケートでないとダメですが、10コピーあれば検出できます。ただし、定量性は落ちますので、一度検量線が作って確認した方が良いと思います（この場合はサンプルの希釈では難しそうですから、プラスミドに組み込むとか、PCRの生成物を使うとか…）。 RT-PCRでのバンドがノンスペかどうかは…確定するにはシークエンスでしょうか。 あと、Taqmanとサイバーグリーンの比較では、一般論としてはTaqmanの方が感度が高い（ノイズを拾いにくい）と思います。

(無題) 削除/引用 No.2164-2 - 2008/10/22 (水) 23:34:26 - うーん real time PCRではポジコンは出てるんですか？ ただRTPCRに使ってる系がreal time PCRでworkしてない可能性を指摘します。

リアルタイムPCRについて 削除/引用 No.2164-1 - 2008/10/22 (水) 21:05:56 - ぴーしーあーる お世話になります。 別のスレで相談させていただいてましたが、 マイクロダイセクションでRNAを抽出し、RTーPCRとTaqmanプローブでリアルタイムPCRを回してます。 標的臓器に発現があることは既知で、RT-PCRにてもかなり薄いですが35サイクルでバンドが見られます。ところがリアルタイムを回してみると検出できませんでした。GAPDHは検出できますしたが。 この場合、どう解釈すればよいのでしょうか？単にリアルタイムでは感度が足りないのでしょうか？ RNAの収量を上げるのは難しいので困ってます。サイバーグリーンの系も考えてますが、Taqmanとサイバーグリーンでは感度は違いはあるのでしょうか？ それとも感度以外の問題でしょうか？

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