いつも参考にさせて頂いています。
現在、組換えタンパク質を作製しようと、コンストラクトの作製にはげんでおります。
今までに、なんどかGST融合タンパク質は作製したことがあるのですが、今回Bio-Radの進めもあり、pPAL7（約6kbp)というベクターを初めて使用しております。
インサート（約250bp)、プラスミドをそれぞれBamHI, EcoRIで処理し、ライゲーション後、大腸菌JM109に形質転換しました。
インサートチェックではきっちりとバンドが出ていたので、ポジティブコロニーをO/N培養し、プラスミドを抽出しました。
その後、確認のために、抽出したプラスミドをBamHI、EcoRIで再度処理して電気泳動してみました。
確かに目的のサイズのフラグメントが切り出されては来たのですが、このフラグメントのバンド強度が極端に弱いのです。一見、直鎖状のプラスミドしかないように思いライゲーションを失敗したのかと思ってしまうほど、目的のフラグメントの濃度が薄いです。
目的のサイズのフラグメントが無ければ、ライゲーション失敗というか、インサートがうまくベクターに入らなかったんだとわかるのですが、ものすごく薄い物の目的のフラグメントがあるというので、うまくいっているのか？と困惑しています。
いくら、塩基の長さが違うとはいえ、そこまで極端に切り出されてきたフラグメントと、直鎖状プラスミドのバンド強度が変わるものでしょうか？
それとも、一つの大腸菌に、セルフライゲーションしたプラスミドと、インサートの入ったプラスミドが共存するというようなことがあるんでしょうか？
二つコロニーをとっている可能性もありますが、１０個以上シングルと思しきコロニーをとって、全て同じ結果なので、それは考えづらいかと思っています。
何か、コメントやご助言頂ければ幸いです。
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