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お礼 削除/引用 No.2160-8 - 2008/10/22 (水) 20:17:36 - Cell 皆さん、たくさんの回答ありがとうございました。 遠心時間なんですが、２minの間違いでした、すみません。 皆さんの意見を総合して、バイセルを買ってもらって、セルバンカーでなく、培地＋DMSOのも試してみたいと思います。 ピペッティングも強すぎたかもしてないので色々試したいとおもいます。 本当にありがとうございました。

バイセル 削除/引用 No.2160-7 - 2008/10/22 (水) 19:07:42 - mom-a うちのボスもおいそれとは買ってくれない気が…自分は使ってなくて困らなかったっていうのがあるんでしょうね。 ＞凍結から起こそうとすると、ほとんど死んでしまって、なかなか起きてくれません。 これは、同じストックから起こしているのですか？違うストックですか？同じストックなら、最悪そのストックは全部ダメ、という可能性もあるのでは…。違うストックだとしても、ストックする時に問題がある可能性は否定できませんね。細胞が少なすぎる、多すぎる、トリプシンのダメージがある、etc... とりあえず、起こす時の1000rpm, 20minは長いと思います。きちんと集められていないような気がするなら、15mLチューブを使う方がよほど効率よく集めらると思います。先が細いですから。 あと、遠心しないでそのままdishに播いてみて、貼り付いてから培地を変える方法はどうでしょう？細胞によってはまずいかもしれないので、必ずしもお勧めできないのですが、これで上手くいくなら、遠心⇒ペレットをほぐすあたりの問題かと。

(無題) 削除/引用 No.2160-6 - 2008/10/22 (水) 18:38:21 - 通りすがり 自分は凍結する時に10%程DMSOを入れています ただ培地で凍らせるだけよりは生存率は上がるようです あと細胞をdishからはがす時のトリプシンの影響で 細胞が死んでしまう事も考えられそうですが… なるべくincubate時間を短くするとか（自分はHEK293で37℃1minで行ってますが）なら考えられますかねえ

(無題) 削除/引用 No.2160-5 - 2008/10/22 (水) 14:07:41 - ~ >細胞の販売会社は上手く扱えていると思うので、何か方法があると思うのですが。。。 何で入手元に保存条件を問い合わせていないのですか？ どこから来たのかも分からない細胞なのですか？ 使っているラボから貰ったのであれば、実際の操作も見せてもらいに行きましょう。 現在起きていないのにバイセルを使わない理由は何ですか？ 実験を進める必要があるのでしたら、条件検討のために2万円弱を使うのは仕方ないのではないでしょうか？ キムタオルで巻いたり、小さい発泡スチロールの容器に入れて、簡易バイセルを作っている人もいますが、 うまくいっていないときには、既製品を使う方が、検討するパラメーターが減らせるでしょう。 DMSOを使わない理由は何ですか？ 確かにセルバンカーはいい結果を得られることが多いと思いますが、 古い株ですので、オリジナルの条件ではありませんよね。 問題が生じているときは、元の条件に戻りましょう。 >遠心は１０００ｒｐｍで２０minなのですが、遠心し過ぎでしょうか？ かなり長めに回していますね。 継代時にそのような遠心をしているのですか？ 丈夫な細胞ならば問題なのかもしれませんが、私なら3~5分くらいにします。 10T1/2はピペッティングに弱かったと記憶しています。 セルバンカーに懸濁するときや、wash後にはピペッティングしていますよね。 強さをいろいろと試してみはいかがでしょうか。 それと、起こした後の撒き数や条件が分かりませんが、 撒き数を濃くしたり、 conditioned mediumを使ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2160-4 - 2008/10/22 (水) 13:30:10 - Cell 回答ありがとうございます。 遠心は１０００ｒｐｍで２０minなのですが、遠心し過ぎでしょうか？ 使っている培地の組成などに間違いはないと思います。 ピペッティングはほぼしてないに等しいです。 また、前々任者・前任者もこの細胞をうまく起こせていないことから、細胞自体が凍結に弱いのかもしれません。 しかし、細胞の販売会社は上手く扱えていると思うので、何か方法があると思うのですが。。。 回答して頂き感謝します。

(無題) 削除/引用 No.2160-3 - 2008/10/22 (水) 13:05:16 - おお そこまで、難しいようには思えないので、何か取り扱いが悪いところに気がついていないか、勘違いがあるか、、、、 -80でそこそこ保存できるはずですが、-80は物の出し入れがの機会が結構あって若干温度があがってしまったり すると随分調子が悪くなることがあるようです。凍結して、翌日とかに１本戻してみてもダメでしょうか? 凍結した日によってばらつきがあったりしますか? バイチは普段その細胞を飼っているボトルから取ったものですか(グルタミン入れ忘れとか)? 遠心は普段その細胞でやってますか? 遠心力が強すぎるとか、細胞をはがす時にちょっとピペッティングが強かったりしたりという 微妙なところでも可也細胞の調子が変わってくることがあります。 もし、バイチが細胞が死んでいるのにバイチが黄色くなりかけているようだったら、マイコプラズマ のコンタミの可能性もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2160-2 - 2008/10/22 (水) 12:55:24 - まっくろん 　細胞を起こす時に、その増殖や生存率が悪いのは「眠らせる時」の問題と、「起こす時」の問題と両方あるように思います。もちろん細胞の性質の影響が非常に大きいでしょうか。 「起こす時」の問題としては、�@遠心が強すぎる�Aピテッティングが多すぎる・強すぎると言った所が問題になりやすいように感じます。50mlチューブを使っておられるようですが、何か理由があるのでしょうか？私の場合は、15mlチューブに9-10ml培地を入れておき、そこに半解凍したものを入れ、遠心にかけます。その際、懸濁はほとんどしないか、やっても極力弱くするようにしています。また、遠心も極力弱くしてます。

細胞が起きてくれません 削除/引用 No.2160-1 - 2008/10/22 (水) 12:29:47 - Cell C3H10T1/2というマウス胎児神経細胞を扱っているのですが、凍結から起こそうとすると、ほとんど死んでしまって、なかなか起きてくれません。 凍結方法 １×１０の６乗個/mLの細胞をセルバンカーに懸濁し、クライオチューブに1mL入れ、−８０℃で保存しています。バイセルは使っていません。 起こす時 凍結したクライオチューブを３７℃水浴で半解凍し、５０ｍLチューブに培地(DMEM　High-glucose＋１０％FBS)を入れたものに懸濁、遠心して上澄を除いたものをdishで培養しています。 しかし、次の日に観察してみると５％も生きていないです。 この細胞が凍結・自由に起こせるようにならないと実験が進めず、困っています。

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