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(無題) 削除/引用 No.2156-12 - 2008/10/24 (金) 00:58:25 - おお >[Re:11] タンパク初心者さんは書きました : 。 > タンパクが作用しているかどうか裏をとるというのは、熱処理やプロテアーゼ処理で > 活性の消失をみるという意味ですか？ > そういう方法が簡便で,よく使われる方法だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2156-11 - 2008/10/23 (木) 23:45:47 - タンパク初心者 皆さんありがとうございます。 　 まずは活性を再現、アッセイできる系を確立するべき、ということですね。 タンパクが作用しているかどうか裏をとるというのは、熱処理やプロテアーゼ処理で 活性の消失をみるという意味ですか？ やはりマニュアルでやろうとすれば、試行錯誤して抽出条件を改良していくしか ないのですね。どのタンパクか見当がついていれば、バンドで確認できるのでしょうが..... 膜タンパクを抽出するキットがあるとは知りませんでした。 価格と相談して検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2156-10 - 2008/10/22 (水) 22:52:42 - おお >[Re:6] タンパク初心者さんは書きました : > ご丁寧なご返信ありがとうございます。 > 本当に参考になると同時に、自分の勉強不足を痛感しています。 > > 扱っているのは動物細胞なのですが、接触する細胞に対して活性を示し、 > condition mediumには活性が無いことから膜上に何らかのシグナルを > 伝えるタンパクがあるのではないかということで、まず細胞から膜フラクションを 接触で活性を示すということですが、それだと膜ひょうざい とはかぎらないですね。 表面に突き出ているが、埋もれている部分もあるかもしれません。 膜フラクションが得られているので、そのフラクションに活性がありますか? 人口的に脂質で2じゅうまくをつくり、そこにTX-100などで可溶化したタンパクなどを 何らかのほうほうでぶんかくしたものをまぜていき、活性のあるフラクション を得るのもてかもしれません。 尿素は第１選択でないようにおもえます。もしほんとに作用があるなら、接触したときと同じような環境を創り出せるとしてpgオーダーで活性がみれてもおかしくないので、精製がどの程度できているかも考えると、重量はあまりあてにならないと思います。 まずは、in vitroで(まくふらくしょんやそのたのほうほうで)活性が見れる系をみつけるのがさいしょで、それにあわして 抽出方法を考える方がいいかと思います。 あと、タンパクが作用しているのかも裏を取った方がいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2156-9 - 2008/10/22 (水) 21:17:51 - aji 膜表在タンパク質を除去するのにNaHCO3が使われるのを論文でみたことがあります。ただ、変性するかどうかは分かりません。 表在タンパクを界面活性剤無しで可溶化できる例はありますが、表在の状態というのはいろいろ議論があるところで、界面活性剤なしの可溶化率は低い場合が多いと思います。 カオトロピックイオンもよく使われますが、世の中には純水で膜から外れるタンパクもあります。

(無題) 削除/引用 No.2156-8 - 2008/10/22 (水) 18:01:21 - TＸ > 扱っているのは動物細胞なのですが、接触する細胞に対して活性を示し、 > condition mediumには活性が無いことから膜上に何らかのシグナルを > 伝えるタンパクがあるのではないかということで、まず細胞から膜フラクションを分離し、粗画分で活性を検定してみようということでその方法を検討していました。 貴殿のやりたいことがいまいちわかりませんが、 膜タンパクを抽出して目的の活性を測定できるんですか？ マニュアルでの膜タンパク抽出に自信がないなら、 キットをとりあえず使うのも手だと考えます。 以前、メルクの営業が宣伝しにきました。 http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/NVG_/717723.20080220.pdf 酵素活性測定に用いることはできるようです。 参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.2156-7 - 2008/10/22 (水) 16:43:49 - EcoRI 濃度にもよりますが尿素を用いると、タンパク質は変性してしまいます。 ですから、機能的なアッセイには向かないと思います。 1 M だとどうでしょうか…。ちょっと心配です。 それから、乾燥もタンパク質にとってはダメージになります。 避けた方がいいと思います。 扱っているのが、動物細胞、ということですから、 トランスフェクションによる過剰発現で活性の上昇を見るか、 RNAiでノックダウンさせて活性が下がるか というのが簡単に思いつくところでしょうか。 どちらにせよ、FACSで目的膜タンパク質のシグナルの挙動を確認する必要がありますが。

(無題) 削除/引用 No.2156-6 - 2008/10/22 (水) 15:36:05 - タンパク初心者 ご丁寧なご返信ありがとうございます。 本当に参考になると同時に、自分の勉強不足を痛感しています。 扱っているのは動物細胞なのですが、接触する細胞に対して活性を示し、 condition mediumには活性が無いことから膜上に何らかのシグナルを 伝えるタンパクがあるのではないかということで、まず細胞から膜フラクションを 分離し、粗画分で活性を検定してみようということでその方法を検討していました。 試しに１M Urea→透析→乾燥で抽出してみましたが、得られたタンパクがごく微量（細胞 vol１ml から数十μg）のため、本当に抽出されているのか不安になり、ここでお伺いしている次第です。

(無題) 削除/引用 No.2156-5 - 2008/10/22 (水) 11:08:06 - おお あ、プロテアーゼを使って遊離させるというのもありますね。

(無題) 削除/引用 No.2156-3 - 2008/10/22 (水) 10:50:34 - EcoRI >このタンパクが膜表在性のものではないか >という予測のもと、抽出を行ないたいと考えています。 この予測はどのような根拠をもとにされたのでしょうか？ アミノ酸配列を疎水プロットすると、膜タンパクらしい、ということでしょうか？ それとも、免疫染色を行うと、膜上にシグナルが見える、ということでしょうか？ 膜タンパク質の精製は、これといった手法はなく、なかなか難しいようです。 界面活性剤(特に重要)、塩濃度、その他添加物(グリセロール、還元剤など)の至適化を行うだけで、 相当の時間と労力を要するみたいです。(なにかの実験書に書かれていました…) おおさんが仰られているように、膜フラクションを取得するのがいいと思います。 もし、クローニングされて塩基配列が判明しているのなら、 適当な細胞にトランスフェクトして、モックの細胞、非トランスフェクト細胞と比較してみる というのも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2156-2 - 2008/10/22 (水) 00:37:36 - おお 葉緑体の膜ひょうざいタンパクの抽出でのそうさで、 まず葉緑体をとる。 葉緑タイのそのターゲットに富む膜フラグメントをえる。 膜フラグメントから、表在たんぱく質を抽出するという 手順でやっていたと思います。 "できるだけ細胞から余分なタンパクが出るのを防ぎ" と仰ってますが、細胞表面(外側)に局在すると思われるものを考えているのでしょうか? いずれにしても膜フラクションを得た方がやりやすいと思います。 溶出はやってみないと分からない部分が多いと思います。 塩濃度(Na、K、Li)、弱い界面活性剤(臨界ミセル濃度いかで使うといいかと思います)処理 場合によっては高濃度トリス(1M位だと思います)が有効であったというはなし もあります。 EDTAも可能せいはあると思います尿素はカオトロピックな作用があるので 高濃度だと膜ごと溶出されそうな気がしますし、変性作用もあります。 どれくらいの濃度が妥当かといわれると 分からないですが。 あとDTTを加えた方がいいかもしれません。

膜表在性タンパクの抽出 削除/引用 No.2156-1 - 2008/10/21 (火) 21:31:23 - タンパク初心者 タンパク精製初心者ですが、よろしくお願いします。 現在ある活性を持つタンパクをターゲットにしているのですが、 このタンパクが膜表在性のものではないか という予測のもと、抽出を行ないたいと考えています。 　 そこで抽出液について検討しているのですが、できるだけ細胞から余分なタンパクが 出るのを防ぎ、かつ除去が容易なものとして、尿素とEDTAを考えています。 　 もし膜表在性のタンパクの抽出をされたことがある方がいらっしゃいましたら、 体験談などをお伺いできればと思います。 よろしくお願いいたします。

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