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(無題) 削除/引用 No.2153-10 - 2008/10/24 (金) 21:26:16 - AP >[Re:9] アスキさんは書きました : > DIG-APの系ではハイブリは1 o/nからシグナルの弱い物は2 o/n行い、 > 抗体も2h処理発色もo/nで行っています。 > この系ではバックも全く近いほどなく非常に安定した結果を得られています。 > > TSAの系では、ハイブリが1 o/nでいいこと＋発色時間が非常に短時間で > 済むという事が魅力的ということで、週２でISHを行えるからという理由で > TSAの系を確立させてくれという指令がきている現状です。 TSAを使う使わないはおいておいて、 ハイブリの時間はプローブの濃度を高めることで短縮できる可能性があります。ふつうにやるとバックが上がりますが、時間を短縮していくとうまくいく条件が見つかるかもしれません。ISHと直接比較は出来ませんが、メンブレンハイブリだと、通常10 ng/mLプローブでO/Nのハイブリと同等の結果が、100-200 ng/mLくらいにしてやると2時間くらいで出来たりします。 また、プローブ鎖長がなるべく短くなるように断片化してやると、ハイブリ速度が上がります。理論的に短い方が速くハイブリが完了するということがあり、また組織への浸透速度が高くなることが期待できます。臨床検査用のISHキットのようなものがあるらしいですが、ハイブリ時間が非常に短く、それはオリゴプローブを使っているからだ、というのをどこかでみた記憶があります。 ハイブリバッファーを工夫しても速度を速めることが出来るかもしれません。デキストラン硫酸のようなものの添加や、フォルムアミドの濃度を下げるとか。 NBT/BCIPの発色はPVAの添加でエンハンスできるとされています。

(無題) 削除/引用 No.2153-9 - 2008/10/24 (金) 10:49:33 - アスキ AP様、お返事ありがとうございます。 こちらではISHでの空間データやGenechipやRT-PCRなどによる 時系列の発現データなどをデータベース化させています。 自動ISHマシーンというのは、うちの場合脱パラ後の作業に関して ハイブリ、発色なども含め全て行うような物になっています。 通常のDIG-APの系ではこのマシーンはきちんと活用できている状況です。 DIG-APの系ではハイブリは1 o/nからシグナルの弱い物は2 o/n行い、 抗体も2h処理発色もo/nで行っています。 この系ではバックも全く近いほどなく非常に安定した結果を得られています。 TSAの系では、ハイブリが1 o/nでいいこと＋発色時間が非常に短時間で 済むという事が魅力的ということで、週２でISHを行えるからという理由で TSAの系を確立させてくれという指令がきている現状です。 ステップが多い分、本当にトラブルの原因を解明するのにAP様のおっしゃる通り 頭を抱えている状況です。

(無題) 削除/引用 No.2153-8 - 2008/10/23 (木) 19:22:26 - AP >ただ、この系ではどんなに早くても発色終了までに３日〜４日を要してしまい、数千クローンのISHを行うのに時間がかかってしまうので、 数千クローンというのはプローブにするcDNAのことで、網羅的なスクリーニングかプロファイリングが目的でしょうか。それで、機械化してTSAを使う系を作れと業務命令ということですか。 機械化はどこからどこまでのステップですか？　ハイブリも組み込まれているやつでしょうか。 ちなみに、TSAを使うことで何にかかる時間を短縮しようとしているのでしょうか？　時間短縮だけならTSAを使うのが得策とは限らないと思うのですけれど。ステップ数が格段に増えますし。

ありがとうございます 削除/引用 No.2153-6 - 2008/10/23 (木) 17:04:26 - アスキ AP様、お返事ありがとうございます 通常のAnti-DIG-APを使用したISHは問題なく確立されています。 ただ、この系ではどんなに早くても発色終了までに３日〜４日を要してしまい、 数千クローンのISHを行うのに時間がかかってしまうので、 TSAの系で短時間で多くこなせるようにしてほしいという指令がきている為 この系を確立しようと悩んでいるという状況です。 ご説明が足りなく、申し訳ありません。 確かに、通常の系でのISHではHCl処理もレバミゾール処理も行っていませんが 非常に良い結果を得ています（書き忘れましたが、TSAではレバミゾールも 平行して行っていました） TSAを使用している方の論文などでも皆さんHCl処理を行っているので 参考にして行っていたのですが、条件がきついというご指摘なので 再度検討してみたいと思います。 また、過酸化水素処理も一般的には0.3％など低濃度で１hなど長時間、 3％など高濃度では5〜10分が多いですよね。 パラフィン切片使用時にはあまり、内在性の物の影響はないとも聞きますが このあたりの処理も皆さんばらつきがかなり激しいです。 次回、この問題の２つの部分を組み込みつつ、ハイブリ後の操作を TSAを使わないDIG-APの系で行ってみて、影響をみてみたいと思います。 色々と情報を頂き、ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.2153-5 - 2008/10/23 (木) 16:51:37 - アスキ in situ様お返事ありがとうございます。 VECTOR社のkit、使用してみる予定です。 内在性ビオチンのブロッキングをハイブリ前にやると、熱で外れてしまうと 言われた事があったのですが、大丈夫のようですね。 ぜひ参考にさせて頂きます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2153-4 - 2008/10/22 (水) 13:33:09 - AP TSAをつかうISHにはなじみがないので、疑問点も含めて補足します。 >TSAがいくら原理的には高感度とは言っても、どんな手技でもステップが増えれば増えるほど落とし穴が増えて、 たとえば、ターゲット分子が変性・分解してもエピトープの構造が残っていればよい免疫染色ならともかく、内在性peroxidaseを失活させるための処理、3% H2O2、一時間てベラボーではないですか（TSAで増感するISHでは当たり前なんでしょうか）？　スーパーオキシドラジカルは核酸にもダメージがあるはずですね。（ターゲットを損なうようでは何のための増感なのかわからないですよね）。 塩酸処理は、AP失活を目的にしなくても浸透化やdepurination（染色体ISHの場合）のためにすることがありますけれど、条件がクリティカルです。多かれ少なかれダメージを与えるので、AP失活だけが目的なら他の方法（レバミソール添加など）ではいけませんか？

(無題) 削除/引用 No.2153-3 - 2008/10/21 (火) 22:10:36 - AP どうしてもTSA増幅をしなければ無理なんでしょうか。 スタンダードなDIG ISH、Anti-DIG-AP検出の系でいろいろ条件検討をしてどうしても無理だったからTSAということですか？　そうでないならまずスタンダードな方法のなかで、いろいろ工夫すべきところがあるのではないでしょうか。 もし、そうしたのだけれど、どうしてもだめだったからTSAを採用したのなら、どんな問題があったのでしょうか。どう工夫しても、全く染まらないとか、染まるには染まるけれど非常に薄いとかでしょうか。一応、スタンダードなDIG ISHは細胞当たり数コピーの転写産物を検出する性能があるといわれていますが。 TSAがいくら原理的には高感度とは言っても、どんな手技でもステップが増えれば増えるほど落とし穴が増えて、最適化やトラブルシュートが難しくなるものです。TSAを使う合理的な理由や明確な狙いがないうちは手を出さないほうがいいと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.2153-2 - 2008/10/21 (火) 20:21:32 - in situ 自分もビオチン標識ISHの高バックグラウンドには苦しめられました。 使用検討しておられるVECTORのavidin/biotin blocking kitはほぼ完璧にバックグラウンドを抑えたので、お勧めです。 使うタイミングとしては、自分はハイブリの前にやってしまっていますが、ビオチン処理の前であればいつでも良いのではないかと思います。 また、アビジン一分子に対してビオチン四分子が結合するらしいので（ビオチンは一つのアビジンにしかくっつけない）、アビジンにくっついているビオチンが、さらにneutravidinにくっつくことはないと思います。

TSAシステムでのISHのバックグラウンド 削除/引用 No.2153-1 - 2008/10/21 (火) 16:29:24 - アスキ 現在マウス脳切片を使用してTSAシステムでのISHを行っています。 シグナルはやや出てはいるのですが、バックグラウンドが高くシグナルが 埋もれてしまっている感が非常に強く、色々検討しているのですが 良い結果が出ず、非常に悩んでいます。 おおまかな流れとして 3% 過酸化水素（1h）、内在性APブロック（HCl15分） DIGラベルプローブでハイブリ（18h）、1%カゼイン/TBS（NaClを150→300mM） ブロッキング（30分）、Anti-DIG-POD（1h）、Biotinyl-Tyramide（15分）、 Neutravidin-AP（15分）、NBT/BCIPで発色させています。 ProK処理やアセチレーションは行っていますが、今後全自動ISHマシーンに 組み込む予定で、分注をwashしながら同一シリンダーから行う機械なので RNaseA処理はできない為、この操作は省いています。 抗体なしでもバックが出た為、内在性のPODか内在性のBiotinが原因かと 考えているのですが、厳しい条件で内在性PODのクエンチングは行っているのでそれも考えずらく… Vector社のAvidine/Biotin Blocking kitを使用予定ですが、 TSAシステムの場合このキットは説明書通り、１次抗体前に使用なのか ビオチン処理前に使用すべきなのかわからず悩んでいます。 また、内在性のビオチンにアビジンを付け、更にアビジンの複数ある ビオチン結合部位をふさいでしまうのはわかるのですが、 その後のNeutravidin処理の際にこのビオチンには結合しないのでしょうか？ 非常に困っています。 何か良いアドバイスなど頂けたら非常に助かります。 宜しくお願い致します。

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