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(無題) 削除/引用 No.2145-10 - 2008/10/23 (木) 09:44:23 - student >[Re:9] ういさんは書きました : > >RNA1マイクログラムあれば十分リアルタイムPCRできると思います。 > > > 通常マイクロダイセクションでのRNA抽出では１マイクロもないことが多いと思います。ナノオーダーだと思われ、ここでの問題はその位のRNAからリアルタイムに持っていけるかということかと思います。 > 質問がごっちゃになってわかりずらいのかもしれませんが、 私が答えたのは一番最初の初心者さんの質問に答えました。 マイクロダイダイセクションしたものをリアルタイムすることはもちろんできますが、増幅効率がわるいものや、発現がすくないものは難しいと思います。 泳動で薄っすらとバンドが見える程度だとリアルタイムは厳しいです。またリアルタイムで測定できたとしてもCt値が高いので誤差の大きいので気をつかないといけません。

(無題) 削除/引用 No.2145-9 - 2008/10/22 (水) 22:50:49 - うい >RNA1マイクログラムあれば十分リアルタイムPCRできると思います。 通常マイクロダイセクションでのRNA抽出では１マイクロもないことが多いと思います。ナノオーダーだと思われ、ここでの問題はその位のRNAからリアルタイムに持っていけるかということかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2145-8 - 2008/10/22 (水) 21:52:04 - student RNA1マイクログラムあれば十分リアルタイムPCRできると思います。 私は逆転写後にわざわざ吸光度ははかる必要ないと思います。 DNAse処理、プライマーをエキソンジャンクションで挟んでいるのであれば、 そのままPCRしてコントロールの遺伝子でcDNA量を補正できるので、そのまま進めてよいと思います。

＞ぴーしーあーるさん 削除/引用 No.2145-7 - 2008/10/22 (水) 16:03:06 - mom-a >RT-PCRしてアガロース上でエイドウするとかなり薄いのですがバンドが見え>ます。そこでリアルタイムでも定量できると思いやってみたのですが検出で>きなかったのです。 > >その場合、ゲルで見えたバンドはノンスペの可能性が高いのでしょうか？ トピ主さんの質問がまだ解決済みになっていませんから、別にトピを立てた方が良いと思います。これはこれで長くなりそうですから。

(無題) 削除/引用 No.2145-6 - 2008/10/22 (水) 15:55:41 - ぴーしーあーる 皆様ありがとうございます。 RT-PCRしてアガロース上でエイドウするとかなり薄いのですがバンドが見えます。そこでリアルタイムでも定量できると思いやってみたのですが検出できなかったのです。 その場合、ゲルで見えたバンドはノンスペの可能性が高いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2145-5 - 2008/10/22 (水) 10:24:40 - mom-a >よくメーカーが1コピーでもあれば検出可能という売り文句をいいますが、実際にはそこまで高感度なのでしょうか。 メーカーさんが売り込みに来た時に、検量線作成用に作ったプラスミドで1000000〜1コピーまで系列希釈（公比10）をつくってやってみました。 （ちなみに、SUYBR Greenで。） 1コピーになると、試薬や機器の性能だけではなく、『PCR用tube中に本当に1copyあるか』どうかも問題になります。その時の条件ではテンプレート1uL/tubeだったのですが、テンプレート1uL中に必ず1copy含まれているか？むずかしそうですよね。 実際、3tubeのうち、検出できたのは1tubeでした。その1tubeに関しては、検量線からそれほど外れていない（厳密にはずれているので、この点を外したほうが検量線の精度が上がる）ようでした。確率の点では（証明できませんのでご容赦）tubeに1コピー含まれている確率が1/3くらいというのは、まぁそんなものかと思うので、tube中に1copy確実にあれば検出は可能のようです。とはいえ、定量の精度は落ちます。

(無題) 削除/引用 No.2145-4 - 2008/10/21 (火) 17:17:20 - ひちみ >5マイクロ以下であるので、 Agilentのバイオアナライザーでならば微量のRNAでも定量と品質確認ができるそうです。 近くにあれば借りに行きましょう。 消耗品が比較的高いので予算的な面でもケアするといいでしょうね。 マイクロダイセクションの試料でも測定可能だそうですよ。 それともう一つの質問ですが、RNAが極端にフラグメント化されてると逆転写のプライマーがくっつくだけの長さがなくて測れない場合もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.2145-3 - 2008/10/21 (火) 12:07:43 - ピーシーアール すいませんついでに教えてください。 よくメーカーが1コピーでもあれば検出可能という売り文句をいいますが、実際にはそこまで高感度なのでしょうか。というのも、マイクロダイセクションでRNA抽出を行いごく微量なものからリアルタイムPCRをしていますが、目的のものが検出できません（RNAの発現は既知）。RT-PCRにてはバンドが何とか見られます。またリアルタイムではGAPDHは検出できます。 このようなときはアプライするｃDNA量をふやしたり、サイクルを上げるなどで解決できることはあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2145-2 - 2008/10/20 (月) 23:05:26 - in situ 確か、nano dropは核酸に共通の波長（260nm）の吸光度を測っているので、逆転写後に濃度を測ると、freeのdNTPやら、プライマーやら、RNAやらの全ての合計値として算出されるはずです。 だから、異常値ではないかと。

リアルタイムPCR 削除/引用 No.2145-1 - 2008/10/20 (月) 22:51:14 - 初心者 現在、リアルタイムPCRの準備を行っている初心者です。 組織が脊髄で採取されるRNAが微量で、5マイクロ以下であるので、RNA量を1マイクログラムにそろえてリアルタイムを行いたいと考えています。 ただ、逆転写後にｃDNA量を念のためナノドロップで測定してみたのですが、どれも異常値（-200ng/ulなど）が出てしまい、RNAが微量なので、逆転者がうまくできていないのではないかと思ってしまいます。GAPDHなどでPCRはまだ行っていないのですが、このような検体を使用して研究を進めていいか悩んでしまいます。どなたか詳しいことを教えていただけますでしょうか。

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