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(無題) 削除/引用 No.2137-3 - 2008/10/18 (土) 00:57:29 - kozakura つまり低温では「部分的かつミスマッチに」会合するだけであり、反応後に温度を上げたり、ハイブリ後の洗浄処理によって容易に乖離させられるということですね。そして１００%マッチで会合を行いたいのであれば、Tm値付近で反応させなければならないということですね。それならば私の理解と一致しています。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2137-2 - 2008/10/18 (土) 00:26:54 - AP 基本的な理論や近似についての古典的な報告があるところなんですが、Molecular Cloning などスタンダードな教科書は読んでいますか？　その辺の記述や近似式を見れば理解できそうなことなんですが。 ハイブリ（アニール）に要する時間は、ハイブリする領域が短いほど速いです。ある程度の長さのあるDNAが、denatureしたあと元通りにrenatureするためにはゆっくりハイブリさせなければなりません。denature後、短時間で冷却した場合は、長い区間のrenatureには不十分で、短い領域の相補性で水素結合が起こった状態で安定するため、自己鎖内あるいは他のDNA分子との部分的な短区間でのゆるい対合が起こります（ミスマッチ、ランダムコイル、ヘアピン）。このような短区間の対合は温和な温度条件に持っていくだけで解離するような不安定なものであり、時間をかければ元通りの二本鎖にもどろうとしますが、短時間ではとにかく熱エネルギー的に少しでも安定な状態にあろうとするため、部分的な対合は起こります。 そのために、Southern, NorthernなどはTmに近い温度でゆっくりとハイブリをするのです。また、臨床検査などで使われるハイブリでは特異性の高いoligoプローブを使って短時間で完了するようにデザインされていたりします（鎖長が短いほどCotが低い）。 PCRのプライマーアニーリングをTmになるべく近づけたほうがいというのも同じことです。短時間に十分温度を下げれば、多少のミスマッチがあっても非特異的なアニーリングをして、即伸長反応が起こるために十分な長さの二重鎖になって安定し、非特異的な増幅の原因になります。

アニーリングやハイブリダイゼーションの温度 削除/引用 No.2137-1 - 2008/10/17 (金) 23:25:09 - kozakura こんにちは。 通常、核酸同士のアニーリングやハイブリダイゼーション時の温度は配列の特異性を高めたい場合はTm値付近を設定しますよね？ 温度がTm値より低くなるにつれてミスマッチな配列同士が会合すると思うのですが、極端に低い温度（0〜4℃）で核酸同士をインキュベートした場合でも マッチ、ミスマッチに関係なくペタペタと塩基配列同士がくっついてしまうのでしょうか？ ２本鎖の核酸をdenatureしてから急冷した場合、１本鎖のままで存在するはずなので、相補的な１本鎖同士を低温でインキュベートした場合は会合しないような気がするのですが、私の考えは間違っているのでしょうか？ つまり、核酸同士が会合する適切な温度が存在し、その温度よりはるかに大きい、またははるかに小さい場合は会合が起きないと考えているのですが、この考えを裏付ける、または否定するような論文や経験をお持ちの方はご教授ください。 よろしくおねがいします。

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